存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达论文

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1、存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达论文.freelineTM2000介导转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度，将病毒上清转染树突状细胞，应用V-survivineⅠ，andthefragmentcontainingsurvivinologousrebinationinbacteria，theextractedplasmidfromthepositivebacteriaeLipofectamineTM2000.Then，theharvestedadenovirussupernatantsl.Theexp

2、ressionofsurvivinintransfecteddentriticcellsedbyVvector）的酶切位点（Kpn1和HindⅢ）分别设计了引物，F：5’-CGGGGTACCATGGGTGCCCCGACGTTG-3’，R：5’-CCCAAGCTTTCAATCCATGGCAGCCAG-3’。目的片段的获得以pcDNA3.0-survivin为模板，用合成的引物作PCR扩增，体系为25μl，其中含10×buffer2.5μl，dNTP(10mmol/L)0.5μl，模板质粒0.5μl，上下游引物各0.5μl，

3、Taq酶0.1μl。热循环程序为:94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环后，72℃再延伸7分钟，4℃保存。取10μlPCR反应液在1%琼脂糖中进行电泳。然后采用的纯化试剂盒，按照说明书对PCR产物进行纯化。穿梭载体的构建用Kpn1和HindⅢ两种内切酶对survivin纯化产物和pShuttle-CMVvector进行酶切，将得到的酶切产物用凝胶回收试剂盒进行回收。利用小牛肠碱性磷酸酶对载体酶切片段进行磷酸化处理，得到的产物片段survivin和载体，用T4DNA连接酶在4℃

4、条件下进行连接，转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，并通过带有卡那霉素（50μg/ml）的LB平板筛选出带有重组质粒的细菌。然后以菌液为模板，用腺病毒载体通用引物进行扩增以筛选出带有目的片段的细菌，用小量抽提试剂盒抽提质粒得到重组质粒（pShuttle-CMV-survivin），送泰京公司测序。腺病毒表达载体的构建同源重组将带有正确目的片段的穿梭载体（pShuttle-CMV-survivin）和对照质粒（pShuttle-CMV）分别用Pme1进行线性化，然后从凝胶中回收，并用来分别转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞（已

5、含有病毒质粒AdEasy-Vector）。用加卡那霉素（50μg/ml）的LB平板筛选带有同源重组质粒的E.coliBJ5183，抽提质粒，Pac1酶切鉴定。同源重组成功的质粒，用腺病毒通用引物进行PCR扩增，以确定重组质粒是否带有目的片段。之后用大抽质粒试剂盒HiSpeedTMPlasmidPurificationkit，分别从含有同源重组质粒（Ad-CMV-survivin、Ad-CMV）的菌液进行大量质粒抽提，以备转染293细胞包装病毒时用。腺病毒的包装取同源重组质粒5μg，用3μl的内切酶Pac1进行线性化，然后

6、用PCR纯化试剂盒进行纯化，将纯化产物利用质脂体LipofectamineTM2000进行转染汇合度达到70%的293细胞。到第8天时，细胞大部分飘浮。用滴管把剩下贴壁的细胞吹起，收集细胞，离心，弃掉上清，加入1mlPBS，重悬细胞，然后移到1.5mlEP管中。在-70℃冰箱与37℃水浴反复冻融细胞4次，12000×g离心10分钟，收集上清，即为原代病毒上清（Ad-CMV-survivin、Ad-CMV），置-70℃冰箱中保存。腺病毒的扩增、滴度测定将得到的原代病毒上清转染汇合度为70%的293细胞，按以上方法收集病毒。

7、然后再将得到的病毒上清转染两瓶50cm2T形瓶、汇合度为70%的293细胞，利用空斑测定法对收集的病毒上清进行滴度测定，最后放置-70℃冰箱中保存。腺病毒介导survivin在DC的表达DC的诱导利用淋巴细胞分离液从浓缩白细胞中分离出单个核细胞，利用贴壁法得到单核细胞，加入生长因子GM-CSF、IL-4到培养液中混合培养，浓度皆为1000U/ml，隔天半换液，并补充生长因子。到第7天加入TNF-α，使其终浓度达50ng/ml，到第9天收集细胞。外源基因survivin蛋白表达的OI为100分别用腺病毒Ad-CMV-sur

8、vivin、Ad-CMV感染DC。第9天收集转染及未转染Ad-SVV(survivin)病毒的DC，加入总蛋白裂解酶100μl和蛋白酶抑制剂1μl，冰浴30分钟，4℃，13000×g，离心10分钟。取上清直接于凝胶加样孔内，进行电泳（浓缩胶60V，1小时；分离胶100V，2小时）。当电泳即将结束时，从电泳槽上取下凝胶