玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响论文

《玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响论文王明明叶发刚葛银林【摘要】目的体外分离纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC），研究玻璃粘连蛋白（VN）在rMSC向成骨方向分化过程中的作用。方法贴壁分离培养法分离纯化rMSC，观察第1、3、5、8、10代细胞的增殖情况，并绘制出生长曲线。选第3代细胞用以VN包被的培养板培养，每4d检测碱性磷酸酶活性及钙结节的形成。结果经贴壁筛选法分离的rMSC生长曲线呈S形，第3、4、5代细胞排列具有典型的漩涡状结构；细胞表达CD44、CD90，而不表达CD34。用以VN包被的培养板培养12d，碱性磷酸酶染色呈阳性.freelesenehymal

2、stemcells(rMSCs)invitro,andstudytheeffectofvitronectin(VN)onosteogenicdifferentiationofrMSCs.MethodsrMSCs,and3rd,4thand5thgenerationmanifestedastypicalarroesenchymalstemcells;vitronectin;celldifferentiation骨髓间充质干细胞（MSC）为骨髓中一群多能干细胞，在不同的因素诱导下可以分化为不同的细胞。启动MSC分化的确切因素尚不十分清楚，周围环境中某些可溶性诱导因子已被成功鉴定，而周围

3、不可溶性成分对成骨诱导的作用相对关注较少。本实验主要研究构成细胞外基质主要成分的玻璃粘连蛋白（VN）在MSC向成骨分化过程中的作用，以探讨MSC成骨分化的确切因素。1材料和方法1.1实验材料EM低糖培养基(GIBCO公司)，胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(SIGMA公司)，羊抗大鼠CD34FITC、CD44FITC、CD90FITC（北京中山生物公司）。1.2实验方法1.2.1大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）的体外分离培养取2月龄EM冲出骨髓，离心去除上清及脂肪，所得细胞悬液以1.0×108/L的细胞密度接种于75mL培养瓶中，在含体积分数0.15胎牛血清L

4、DMEM完全培养液中，37℃、体积分数0.05CO2、饱和湿度条件下培养，3d后首次换液，去除未贴壁细胞。以后每2～3d换液1次，待贴壁细胞融合90%时，以2.5g/L胰蛋白酶消化、传代。贴壁细胞融合90%时即传代1次，传至第3代时进行实验。1.2.2rMSC的生长曲线绘制分别取第1、3、5、8、10代细胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化后加入LDMEM完全培养液，调整细胞密度至1.0×107/L，接种于5个24孔板，每孔加细胞悬液1.0mL。每天每板取3孔消化，制成细胞悬液，混匀，计数并取平均值，连续9d，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制生长曲线。1.2.3rMSC的鉴定①形态学

5、观察:在倒置显微镜下定期观察细胞生长情况。②细胞表面标志鉴定:取第3代细胞消化、计数、离心，加入200μLPBS制成细胞悬液。设置阴性对照，加入羊IgG1FITC;其他管分别加羊抗大鼠CD34FITC、CD44FITC、CD90FITC以及细胞与荧光素共轭抗体抗CD29、CD34、CD90，在黑暗中孵化15min。流式细胞仪检测细胞表面抗原表达情况。1.2.4rMSC与VN共培养及相关指标检测在rMSC传代3次后，将指数生长期细胞用LDMEM调细胞的密度为3.0×103/cm2，接种于用纯化的VN包被的24孔培养板中，以成骨诱导液为阳性对照，以含体积分数0.15胎牛血清

6、LDMEM完全培养液为阴性对照，每3d换液1次，在培养至4、8、12和16d时分别进行碱性磷酸酶染色和钙离子沉淀测定。碱性磷酸酶染色：向培养板中加入双蒸水配制的萘酚ASMX磷酸盐和FastblueRR溶液，孵育，显微镜下测定染料沉积情况。钙离子沉淀的测定：用30g/L的多聚甲醛固定细胞30min，双蒸水洗2次，暗处与50g/L的硝酸银溶液孵育10min，双蒸水洗后暴露于强光下1h，计数染色细胞沉积颗粒的数目和大小。2结果原代培养细胞12h可见细胞贴壁，3d后大部分细胞贴壁，第1次换液后细胞4h贴壁，细胞呈多角形、菱形，可见集落形成;9～10d细胞间相互融合达90%。传代后细胞4

7、h贴壁，生长迅速，细胞呈较为均一的梭形、多角形，并呈漩涡状排布。rMSC生长曲线呈S形，第3～5代增殖迅速，1代和8代次之，10代生长明显减慢（图1）。分离纯化的细胞不表达造血细胞表面标志CD34，而强表达CD44、CD90，说明所提取、纯化的细胞是MSC，而不是成纤维细胞或造血干细胞。诱导组第8天细胞碱性磷酸酶染色可见棕黑色颗粒，第12天棕黑色颗粒明显增多增大，提示碱性磷酸酶染色阳性，而阴性对照组无此颗粒。硝酸银染色诱导组呈多量黑色颗粒，而阴性对照组无此颗粒，阳性对