新生小鼠小肠cajal间质细胞增殖的实验研究论文

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1、新生小鼠小肠Cajal间质细胞增殖的实验研究论文【摘要】目的探讨在新生小鼠小肠Cajal间质细胞（interstitialcellsofCajal，ICC）的发育过程中是否出现增殖。方法采用新生2d（P2d）、14d（P14d）和24d（P24d）的小鼠小肠，应用BrdU腹腔注射，24h后取材，Kit和BrdU免疫荧光染色。结果P2d小鼠小肠，可见大量Kit/BrdU双重标记阳性细胞，这些细胞的形态与成熟ICC基本相似，这些细胞在P14d时减少.freelurinesmallintestineduringpostnatalperoi

2、dYUBin,HANJuan,MEIFeng(DepartmentofHistologyandEmbryology,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)Abstract:ObjectiveToinvestigatetheappearanceofinterstitialcellsofCajalproliferationduringpostnataldevelopment.MethodsPostnatalmiceaged2days(P2d),14days(P14d)a

3、nd24days(P24d)munohistochemcalstainingedtorevealtheproliferativeICC.ResultsKit/BrdUdoublelabelingcellsallintestineof2daysoldmice,andthesecellsilaratureonesinfeatures.AndthosecellsreducedatP14dandvanishedatP24d.ConclusionOurresultindicatedthatICCproliferateduringthepos

4、tnataldevelopment,andtheproliferationgraduallyreducedandvanishedbeforeadulthood.Keyg/g）。1.2.2免疫细胞化学染色BrdU注射24h后取各组小鼠小肠，0.01mol/LPBS冲洗小肠，100%丙酮固定小肠20min，解剖显微镜下，用镊子撕去小肠的粘膜层和粘膜下层，获得小肠平滑肌层铺片。PBS漂洗3次，每次5min。1%BSA孵育30min后加入第一抗体，Kit单克隆抗体（1∶100）4℃48h，Cy3标记的兔抗大鼠IgG抗体（1∶100）25℃6

5、0min。随后4%多聚甲醛固定10min，2mol/LHCl处理标本30min（室温），PBS漂洗3次，每次5min，加入第二个一抗，BrdU单克隆抗体（1∶100）4℃48h，FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体（1∶100）25℃60min。水溶性封片剂封片。激光共聚焦显微镜（LeicaTCSSP5）或者荧光显微镜观察照相，Cy3和FITC分别用528nm和488nm光波激发。对照实验以正常鼠血清代替一抗，或兔血清代替二抗，各步骤间用PBS漂洗3次。1.3半定量分析及统计学处理选各组铺片5张，荧光显微镜下随机选择10个视野，统计Ki

6、t阳性和Kit/BrdU双标记阳性的细胞数量，统计结果用SPSS11.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05具有显著性差异。2结果Kit免疫荧光显示，Kit阳性的ICC在肌间神经丛周围呈网络状分布，P2d组ICC网络基本形成，但是细胞数量较少，而且细胞的突起较少（图1a），说明此时的ICC多为幼稚细胞。P14d组小鼠小肠ICC细胞密度较高，形成较完整的细胞网络（图1b）。P24d组小肠ICC具有粗大的初级突起和多个次级突起，这些突起相互之间连接成细胞网络（图1c）。统计结果显示生后不同时期ICC的细胞密度存在明显差别（P＜0.05）

7、。a：生后2d，ICC细胞数量较少，细胞突起较细而稀疏；b：生后14d可见ICC的突起较粗大并有多级分支，形成细胞网络；c：生后24d，ICC细胞网络完整，可见细胞突起相互连接图1Kit免疫荧光染色显示生后不同时期小鼠小肠ICC的变化BrdU染色标记在细胞核，Kit/BrdU双重免疫荧光染色显示，在P2d组小肠存在较多双标记阳性细胞，这些细胞的外形与成熟ICC略有不同，细胞的突起较细而稀少（图2a～c），计数显示双标记阳性细胞密度约为178个/mm2。P14d组双标记阳性细胞减少，大约为100个/mm2，此时双标记阳性细胞的形态与成

8、熟ICC基本相似（图2d～f）。而在P24d组未见双标记阳性细胞出现（图2g～i），说明接近成年时ICC增殖已停止。统计学分析，各组Kit/BrdU双标记阳性细胞数量存在显著差异（P＜0.05）。对照实验结果均为阴性。3讨论本研究组最