小麦总rｎa的小量快速提取

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1、小麦总RＮA的小量快速提取小麦总RＮA的小量快速提取　摘要：以小麦幼苗的叶、茎和根组织为材料，采用ＣＴＡＢ法和尿素法分别提取其总ＲＮＡ。结果表明，ＣＴＡＢ法提取的总ＲＮＡ经电泳检测，２８SｒＲＮＡ和１８SｒＲＮＡ带型完整；Ａ２６０／Ａ２８０的比值接近２，纯.L.度较高；将提取的总ＲＮＡ反转录合成ｃＤＮＡ，可用于ＲＴ－ＰＣＲ分析。尿素法提取叶和茎组织的总ＲＮＡ质量较好，但提取根组织的效果较差。说明ＣＴＡＢ法较适合小麦幼苗各组织总ＲＮＡ的提取。同时，两种方法提取过程中均不使用液氮，可节约试验成本。　　关键词：小麦；总ＲＮＡ；提

2、取　　　　　　高质量ＲＮＡ的提取是分子生物学研究的重要一环，直接影响ｃＤＮＡ文库的构建、基因克隆以及表达分析等。小麦是重要的农作物，其ＲＮＡ提取方法较多［１－５］。尽管这些方法提取的ＲＮＡ质量较好，但都要使用液氮，提高了试验成本。本研究采用ＣＴＡＢ和尿素法分别提取小麦幼苗的根、茎和叶组织的总ＲＮＡ，为小麦总ＲＮＡ的提取提供了一条新途径。　　１材料与方法　　１．１植物材料　　小麦杂交品种郑麦９０２３购于荆州市农资大市场，播种于温室，在苗期分别取根、茎和叶组织用于ＲＮＡ的提取。　　１．２方法　　１．２．１ＲＮＡ提取液成分ＣＴＡ

3、Ｂ法ＲＮＡ提取液成分：２０ｇ／ＬＣＴＡＢ，２０ｇ／ＬＰＶＰ，１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ值８．０），２５ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０），２．０ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，混匀灭菌，用前每１００ｍＬ提取液加入２ｍＬ２－巯基乙醇。　　尿素法ＲＮＡ提取液成分：７ｍｏｌ／Ｌ尿素，５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－HＣｌ（ｐＨ值８．０），１０ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０），３．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１ｇ／ＬＳＤＳ。　　１．２．２ＲＮａｓｅ灭活离心管和移液器吸头用１ｍＬ／ＬＤＥＰＣ水浸泡２４ｈ；研钵等用少量的无水乙

4、醇灼烧，然后用锡箔纸包装；Ｔｒｉｓ试剂用灭菌的１ｍＬ／ＬＤＥＰＣ水配制，其他试剂均用未灭菌的１ｍＬ／ＬＤＥＰＣ水配制；最后，将以上所有试剂或物品高压灭菌４０ｍｉｎ。　　１．２．３尿素法提取ＲＮＡ步骤①取０．２ｇ材料，加入研钵中，加入２ｍＬ提取液，迅速充分研磨；②快速分装到两支１．５ｍＬ的离心管中，于４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；③取上清液，加１／３体积的３ｍｏｌ／ＬＮａＡc（ｐＨ值５．３），１／５体积的氯仿／异戊醇（２４∶１），混匀后冰浴２０ｍｉｎ；④于４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；⑤取上清液加入等

5、体积冰浴冷却的异丙醇，冰浴１０ｍｉｎ；⑥于４℃、５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；⑦沉淀溶于５ｍＬ含有１ｇ／ＬＳＤＳ的ＴＥ缓冲液中，加入８ｍｏｌ/ＬＬｉＣｌ至终浓度２．５ｍｏｌ/Ｌ，冰浴３ｈ；⑧于４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；⑨７０％（Ｖ／Ｖ）乙醇洗涤沉淀两次，空气干燥后溶于ＤＥＰＣ处理水中，保存于－７０℃冰箱中备用。　　１．２．４ＣＴＡＢ法提取ＲＮＡ步骤①将提取液置于６５℃水浴锅中温浴３０ｍｉｎ，将研钵放在烘箱中低温烘热；②取０．２ｇ材料于研钵中，加入２ｍＬ提取液，迅速充分研磨，然后快速分装到两个１．５ｍＬ离

6、心管中，轻轻混匀，置于６５℃水浴锅中１０ｍｉｎ；③加入等体积的氯仿／异戊醇，混匀后在４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ条件下离心１０ｍｉｎ，吸取上清液；④重复上述步骤，并在合并的上清液中加入１／４体积的８ｍｏｌ/ＬＬｉＣｌ溶液并混匀，４℃过夜；⑤４℃１００００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，弃上清液；⑥加入５０μＬ的灭菌ＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ，再加入１／１０体积的３ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ和２倍体积的无水乙醇，于－７０℃放置３０ｍｉｎ；⑦于４℃、　　１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，弃上清液，用７０％（V/V）的乙醇清洗沉淀，吹干后加入

7、３０μＬ的灭菌ＤＥＰＣ水溶解，保存于－２０℃冰箱中备用。　　１．２．５总ＲＮＡ完整性检测　　１）琼脂糖凝胶电泳检测：电泳槽用１ｍＬ／ＬＤＥＰＣ水浸泡２４ｈ，用１ＭＯＰＳ作为电泳缓冲液。取２μＬＲＮＡ溶液于１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳检测，电压为９０Ｖ。　　２）紫外分光光度计检测：取４μＬＲＮＡ溶液，用分光光度计测定Ａ２６０和Ａ２８０的值。每种组织取３份ＲＮＡ溶液样品，求平均值。　　３）ＲＴ－ＰＣＲ分析：使用ＰｒｏｍegaｃＤＮＡ第一链合成试剂盒，合成ｃＤＮＡ第一链。反应完成后，将合成产物稀释５倍，取１μ

8、Ｌ用于ＲＴ－ＰＣＲ的模板ｃＤＮＡ。根据小麦ａｃｔｉｎ基因（ＡＢ１８１９９１）设计１对引物，左引物为：５′ＣＡＡＧＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＴ３′，右引物为：５′ＴＴＧＴＧＣＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴ３′。ＲＴ－ＰＣＲ反应体系为２５μＬ：即１０Ｔ