大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定论文

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1、大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定论文徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α-SM-actin)。结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌

2、动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞AbstractObjectiveToestablishtheculturemodelofrataortavascularsmoothmusclecells(VSMCs)toprovideimportantexperimentalmethodforthepathogenesisresearchofatheroscler

3、osisinvitro.MethodsEmployingtheexplantstechnique,theprimaryandsub-cultureodifiedtissue-pieceinoculationandtrypsindigestionrespectively.Theculturedcellsicroscopyandimmunohistochemicalandimmunofluorescentstaining.ResultsAfter3daysofinoculationoftissue-pieces,VSMCsmigratedfr

4、omthevesselpieces.Theculturedcellsshoorphologicalfeaturesunderthemicroscope.Immunohistochemicalandimmunofluorescentstainingonoclonalantibodyagainstmouseα-SM-actindemonstratedthesecellspleandreliablemethodforobtaininghighlypurifiedandsatisfactoryVSMCsinshortterm,providinga

5、favorableexperimentalplatformforresearchintothemechanismofvascularproliferousdiseasessuchasatherosclerosisandrestenosis.Keyethod;vascularsmoothmusclecells血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neoin

6、timaformation)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)密切相关1~4。因此，研究防治VSMCs增殖与迁移成为血管生物学领域研究的热点。本研究在参考国内外文献的基础上5~8.freela)、T25塑料培养瓶(Costar)、特异性鼠平滑肌肌动蛋白抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)、FITC标记的羊抗鼠荧光二抗(SantaCruzBiochem)1.2大鼠VSMCs的分离与原代培养SPF级雄性SD大鼠1只,重约150g，颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒2min，同时用酒精浇灌大鼠的胸腹部，移入超净台

7、内。无菌条件下迅速取出全段胸主动脉,立即移入含冷PBS的无菌平皿中。使用1ml的一次性注射器拔去针尖后吸取PBS清洗去除血污，眼科镊去外膜结缔组织，此时将洁净血管转移到另一含冷PBS的无菌平皿中，用眼科剪小心剪去血管绒毛后用两弯镊反向牵拉去除外膜，再用眼科弯镊穿过血管沿两端来回牵拉一次，纵向剖开血管，使内膜面朝上,并用弯镊摊平血管，再将血管转移到含DMEM(10%胎牛血清)的无菌平皿中，用DMEM培养液清洗中膜层平滑肌数次后，用眼科弯剪剪切成约1mm3大小的组织块;将组织块(约15个小块/段血管)均匀贴放于25cm2培养瓶底的一处角落，间

8、距0.1cm;向瓶内加入2ml含20%胎牛血清的DMEM培养液，将培养瓶直立置于37℃、5%CO2培养箱中6h，使组织块干涸并与瓶壁牢固贴附。6h后再次翻转培养瓶使组织块浸没于培养液中,培养箱