稳定表达bcl┐2蛋白的肝细胞癌细胞株的建立与鉴定论文

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1、稳定表达Bcl┐2蛋白的肝细胞癌细胞株的建立与鉴定论文.freela，hepatocellular;transfec-tion;geneexpressionAbstract:AIMAhepatocellularcarcinoma（HCC）cellstrainechanismofanti-apoptosisgenebcl-2intheapoptoticprocessofHCC.METHODSTheretroviruseukaryoticexpressionvectorpDOR-SBcontaininghumanbcl-2geneptyvectorpDORanHCCce

2、lllineHCC-9204cells，e-mediatedgenetransfectionmethod.Thecellclonesintomunocytochemicalmethod.ThepDOR-SB-tranfectedcellsescontinuallybylim-iteddilutionmethoduntilanHCCcellstrainthatcanexpressBcl-2proteinata100%positiverateonstrateda1.9-kbbcl-2genefragmentafterpDOR-SBbeingcutmunocytochem

3、icaldetectionindicatedthatBcl-2pro-teinostofthepDOR-SB-transfectedcells，butthereescontinually.CON-CLUSIONHCCcellstrainthatcanexpressBcl-2proteinstablyhasbeenestablishedsuccessfully，anditisnamedasHCC-bcl2.0引言Bcl-2是最早在B细胞淋巴瘤中发现的一个抗凋亡基因.许多研究表明，bcl-2能够抑制多种因素诱导的多种细胞的凋亡［1］.虽然Bcl-2在许多肿瘤中呈异常的高

4、表达，但是原发性肝细胞癌（以下简称肝癌）只能低表达或不表达Bcl-2［2-6］.目前关于bcl-2基因与肝癌细胞凋亡关系的报道较少，对于bcl-2基因在肝癌细胞凋亡过程中是否具有调节作用尚不明确.我们用基因转染技术把bcl-2基因转入不表达Bcl-2蛋白的肝癌细胞系HCC-9204细胞中，建立稳定表达Bcl-2蛋白的肝癌细胞株，为进一步进行bcl-2基因在肝癌细胞凋亡过程中作用的研究奠定基础.1材料和方法1.1材料插有正向bcl-2cDNA（1.9kb）的pDOR-SB逆转录病毒真核表达载体为本校生物化学教研室朱峰博士惠赠.大肠杆菌菌株HB101为本校生物化学教研室

5、惠宏襄博士惠赠.人肝癌细胞系HCC-9204为本室建立，用含100mLL-1新生牛血清的RPMI1640培养液在50mLL-1CO2条件下培养.INE转染试剂盒和G-418为美国Gibco公司产品.鼠抗人Bcl-2单克隆抗体（mAb）为美国Oncogene公司产品.免疫组化ABC试剂盒为美国Vector公司产品.1.2方法1.2.1pDOR-SB载体的鉴定及pDOR空载体的获得提取pDOR-SB质粒，经EcoRⅠ酶切后，8gL-1琼脂糖凝胶电泳鉴定.回收并纯化6.5kb的基因片断，经T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌HB101.1.2.2基因转染和细胞克隆筛选用脂质

6、体载体LipofectAMINE将pDOR-SB质粒转染HCC-9204细胞，同时设pDOR空载体转染对照和不转染的HCC-9204细胞对照.3d后换用含G-418（500mgL-1）的RPMI1640培养液（含100mLL-1新生牛血清）继续培养，约2～3LL-1乙醇固定15min.分别经3mLL-1H2O2和3mLL-1TritonX-100处理后，加正常羊血清，37℃，30min.加鼠抗人Bcl-2mAb，37℃，1h.加生物素化的羊抗鼠IgGmAb，37℃，30min.加ABC复合物，37℃，30min.上述各步之间均以PBS振洗.用新鲜配制的DAB显色10

7、min.用苏木精稍微衬染.脱水，透明，封片.1.2.4转染细胞的有限稀释法克隆化用胰蛋白酶消化并用培养液吹散转染细胞的G-418抗性克隆.准确计数细胞后，系列稀释至每毫升含10个细胞.加入到96孔培养板，100μL孔-1.5d后观察并计数单克隆细胞孔，并取单克隆孔细胞爬片后进行Bcl-2mAb的免疫细胞化学染色.连续进行多次克隆化，直至所有的单克隆孔都为Bcl-2染色阳性.2结果2.1pDOR┐SB真核表达载体的鉴定pDOR-SB质粒经EcoRⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示除了8.4kb（部分未切开的pDOR-SB）条带以外，出现了6.5kb（切开的pDOR空载体