第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体.doc

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1、第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系b-半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬

2、菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。1．单链DNAphage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RFDNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RFDNA：ReplicationFormDNA。B．RFDNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。C．不受包装的限制。因为单链DNAphage的大小是受其DNA多寡制约的。D．可容易地测出外源DNA的插入取向。E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链

3、DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13phage的生物学特性A．M13phage同f1phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。B．在M13phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。C．复制型双链DNA(RFDNA=ReplicationFormDNA)感染过程：当感染的M13phag

4、e颗粒穿过性须时，其外层主要衣壳蛋白质脱落，M13DNA及附着其上的GeneⅢ蛋白进E.coli细胞内，↓感染性单链DNA(正链DNA)在细菌胞内酶的作用下转变为双链DNA，称复制型DNA。通过q结构进行几轮复制。↓当基因Ⅱ产物在亲代RFDNA的正链特定位点上产生一个切口时，病毒基因组的扩增即告开始。↓E.coliDNA聚合酶I以环状的MB负链模板合成正链的MBDNA(pdI将单核苷酸不断加到游离的3¢-CH上合成(+)DNA)。↓当复制叉环绕模板整整一周时，新合成的正链由基因II产物切去，经环化后形成单位长度的病毒基因组。*1.只形成(+)DNA的原理：当每个感染细胞中合成出2

5、00个(+)DNA时，便会产生出单链结合蛋白质。这种蛋白质通过同(+)链DNA结合，从而阻断了(-)链DNA的合成。*2.单链DNA结合蛋白(即GeneV产物)的功能有如下两方面：①阻断GeneIImRNA的转译；②与新合成的(+)DNA结合，阻止其再转变成RNA/DNA。图M13phage在感染的E.coliCell内的复制过程，前四步发生在感染后的15-20分钟。导致每个寄主细胞内积累100-200个环状RFDNA分子，随后持续产生单链(+)DNA并形成子代病毒颗粒。因此在感染的细胞内，RFDNA的分子数目和子代(+)DNA的产生速率都能够保持适度。D．异常的形态发生(大的克

6、隆能力)与大多数其他细菌病毒不同，M13并不是在细胞内组装成噬菌体颗粒，而是在GeneV蛋白-DNA复制物移动至细菌细胞膜的同时，GeneV产物从正链上脱落，而病毒的基因组从感染细胞的细胞膜上溢出时被衣壳蛋白所包被。由于病毒基因组并不需要导入一个预先形成的结构之中，因此，对于可被包装的单链DNA的大小并无严格限制。E．M13是非溶菌的，因此不会形成真正的噬菌斑，实验中所见到的M13噬菌斑乃是由于感染细胞生长缓慢所致，其生长速率通常只为正常生长速率的1/2-3/4。每个感染细胞每个世代可产生数百颗粒，因此培养基内可聚集大量的病毒颗粒，其效价可达1012pfu/ml。二、M13克隆体

7、系1．M13克隆体系A．M13mp载体系列是Messingetal.,构建的。这个载体系列都是从同一个重组M13噬菌体M13mp1改造而来。M13mp1在其主要基因的间隔区插入了一段带有b-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列及其N端头146个氨基酸的编码信息。B．M13克隆体系的寄主菌寄主菌的F¢因子含有缺陷型的b-半乳糖苷酶基因，它所编码的多肽没有活性，并缺失第11-41位氨基酸。这种寄主菌当其感染了没有外源DNA插入的M13时，在感染细胞中产生的b-半乳糖苷酶N端片段与寄主