γ干扰素释放试验快速诊断肺外结核的探讨

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1、y干扰素释放试验快速诊断肺外结核的探讨陈永芳1,2李晟磊1李瑞2陈裕2于永敏2(1郑州大学基础医学院病理教研室河南郑州450000)(2郑州市第六人民医院呼吸五科河南郑州450015)【摘要】目的探讨γ干扰素释放试验(T-SPOT.TB)对肺外结核快速诊断的应用价值方法采用结核杆菌感染T-SPOT.TB试剂盒对外周血标木检测，根据斑点数推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应T细胞，对结核杆菌感染进行辅助诊断。结果结核分枝杆菌特异性T细胞阳性率，肺外结核组与两对照组比较，差异均有显著统计学意义(P<0.05＞，T-SPOT.TB检测结核特异T细胞方法的敏感性为68.9%,特

2、异性84%。结论T-SPOT.TB技术对隐性结核有诊断价值，有助于肺外结核的诊断和治疗。我市结核分枝杆菌的感染情况较为严重，在结核病防治工作中应给予充分重视。【关键词】结核分支杆菌T-SPOT.TB肺外结核【中图分类号】R521【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2013)38-0068-02据“全国第五次结核病流行病学抽样调查报告”，中国是全球22个高负担国家之一，结核病人数居全球第2位。属于高疫情地区［1］。临床上常常遇到临床表现不典型的肺结核病和肺外结核病，目前用于结核病的诊断方法有限，也缺乏快速敏感的实验室技术，为结核病的早期诊断与治疗带来网难。酶联免疫斑点(Enzy

3、melinkedimmu—nospotassay,ELISPOT)技术是一种新型的免疫酶技术，从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞［2】。由ELISPOT发展而来的结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)技术用于检测结核感染后特异性T细胞分泌的干扰素(IFN-γ),并据此结果判断是否感染结核具有高度的敏感性和特异性，目前己广泛应用于临床诊断结核分支杆菌感染的相关疾病。木文就我院就诊的肺外结核病患者用T-SPOT.TB方法检测，探讨其对肺外结核快速诊断的应用价值。1材料和方法1.1对象收集选自2012年6月至2013年2月于郑州市第六人民医院就诊的30名健康体检者

4、，年龄18〜50岁。30例非结核疾病患者，其中，6例肺癌，10例肺气肿，10例糖尿病，4例关节脓肿。以上病例均结合相关辅助检查，临床确诊排除结核感染。肺外结核患者45例，年龄18〜72岁，所奋患者均经病理检测或穿刺物查到抗酸杆菌确诊。苏中淋巴结结核10例，骨结核5例，结核性腹膜炎10例，结核性胸膜炎17例，肾结核3例。所冇检测均于早晨取血10ml。1.2试剂和仪器CO2细胞培养箱，结核杆菌感染T-SPOT.TB试剂盒。1.3外周血单个核细胞的分离和计数采集4ml外周血标本于8ml柠檬酸钠抗凝的真空采血管VacutainerCPT(BD)内，血标本注入管子后，立即轻轻颠倒5次，充分混匀血和

5、抗凝剂。按试剂盒操作，制备细胞沉淀悬液。在1.5ml,离心管中加入10ul已制备样品细胞悬液和40ul的0.4%台酿兰(trypanbIue｝，制备I:5细胞稀释液。取10u丨台酚兰/细胞混合悬液加入血细胞计数板并进行活细胞计数计算每毫升细胞数量。手工使用血细胞汁数板，计数4×4大格含O.luI样品。每毫升细胞数量=细胞计数×稀释倍数×104计算细胞稀释需要的体积并加入相疲的AIM—V无血清培养液制备成终浓度为250000/100ul的稀释细胞工作液。1.4检测分别加人50ul培养基，阳性质控物，结核分枝杆菌特异抗原A和B于相对疲阴性对照和阳性对照孔，

6、A和B检测孔。对于每个标本加入100uI浓度为250000/100ul的稀释细胞工作液。37°C5%C02孵育16〜20hrs。PBS洗板4次。加入50ulBCIP/NBT底物溶液至所有孔中。室温孵育7min。用去离子水充分洗涤孔的内部终止反应，在37°C2-3h或室温过夜干燥培养板。使用德国AIDread酶联斑点计数仪计数每个孔中的冇色斑点。1.5结果判断阴性对照孔斑点数为0-5,阳性样本应为：（抗原A或抗原B斑点数）一阴性对照孔斑点数≥6点；或阴性对照孔斑点数≥6点，阳性样本应为：（抗原A或抗原B斑点数）≥2×（阴性对照孔斑点数）。如果阳性对照孔结果良好

7、，但抗原A或抗原B均达不到阳性样本判断标准，则结果为阴性。1.6统计学分析检验结果均用阳性表示，采用卡方检验方法，应用SPSS13.0软件进行分析。2结果结核分枝杆菌抗原特异T细胞反应频率比较见下表。表结核分枝杆菌抗原特异T细胞反应频率比较结核分枝杆菌特异性T细胞阳性率在正常健康对照组和非结核疾病组间的差异无显著意义（P>0.05），而结核病组均高于前两组（P<0.05）,45例结核病患者中结核抗原特异细胞阳性率68.9