实验二蛋白质含量的测定凯氏定氮法

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1、实验二蛋白质含量的测定―凯氏定氮法一目的：学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理掌握蒸馏、滴定操作技术三聚氰胺C3N6H6“蛋白精”二、原理：蛋白质含N量约为16％，测出含氮量推知蛋白含量。消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮---硫酸铵。添加硫酸铜和硫酸钾的混合物，前者为催化剂，后者提高硫酸沸点。CH2NH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2十4H2O十NH32NH3+H2SO4(NH4)2SO4蒸馏吸收：浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸氨后使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂变色(NH4)2SO4+2Na

2、OH→Na2SO4+2H2O+2NH3↑NH3+HBO2→NH4BO2（H3BO3→HBO2+H2O）滴定：标准HCl滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)，计算出样品中的总氮量。NH4BO2+HCl→HBO2+NH4Cl消化蒸馏、吸收滴定三、试剂与器材1、消化液：H2O2：H2S04：H2O=3：2：12、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物K2S04与CuS04.5H20以3：1混合3、30％氢氧化钠溶液4、2％硼酸溶液5、标准盐酸溶液(约0.01mol／L)6、混合指示剂(田氏指示剂)由50mL0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200

3、mL0.1％甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存。酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。7、待测样品1.凯氏烧瓶2.凯氏定氮仪3.分析天平4.酸式滴定管5.烘箱6.消化炉7.容量瓶等等四、操作方法1.消化前样品处理固体样品:某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(％)。固体样品105℃烘干至恒重。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。2、消化取凯氏烧瓶标号。各加几颗玻璃珠;1及2号瓶中各

4、加样品0.1g，催化剂200mg，消化液5mL。3及4号瓶中各加相同量的催化剂和消化液-----对照，以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。消化开始时应控制火力，不使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力消化，直至消化液呈透明淡绿色。定容：冷却后，加蒸馏水(慢加，随加随摇)。将瓶中液体倾入50mL或100mL容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶，定容。加样时应直接送人瓶底，不要沾在瓶口和瓶颈上。3、蒸馏吸收：改进型凯氏定氮仪特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。1)水蒸汽发生器和反应室2)冷凝

5、器和通气室3)排水柱关键：搞清水管系统蒸馏器的洗涤１.接通冷凝水，向蒸汽发生器中加入一定量的水(以排水口高度为宜)，酒精灯加热烧开。２.水的自动喷出：将蒸馏水从加样室加入反应室将酒精灯移开片刻，反应室内水自动喷出到蒸汽发生器打开蒸汽发生器出水口，放水。如此反复清洗3-5次。３.清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5mL，2％硼酸溶液和1～2滴指示剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。蒸馏吸收准备:取50mL锥形瓶3个，各加入5mL硼酸溶液和1滴指示剂，溶液呈淡紫色，表面皿覆盖备用。关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将锥形瓶放在冷凝器下，冷凝器下端浸没

6、在液体内。加样:移液管取3mL消化液（空白液和样品消化液分别做），加入反应室，用小量筒加NaOH溶液5mL，关闭自由夹，少量水封口。蒸馏:关闭自由夹，打开冷凝水。点燃酒精灯，蒸馏开始，锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时(约2-3分钟)开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，表面皿覆盖。蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。重复3次。最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。4、滴定全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。注意：使用前检查酸式滴定

7、管漏不漏？漏的话，涂凡士林滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！及时记录读数要求：空白液1次，样品消化液2次5、计算总氮量(％)=c为标准盐酸溶液摩尔浓度(0.0098M)；V1为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mL数；V2为滴定空白液用去的盐酸溶液mL数；w为样品重量(1g)。14为氮的相对量子质量。消化液总量500ml,蒸馏时消化液用量3ml样品蛋白质含量(％)=总氮量×6.25注意事项冷凝水的开、关自由夹：中间酒精灯：加到2/3，防止燃烧中途不够蒸汽发生器中：水到瓶颈凹陷处火焰小心照看，防止反应液喷出防止烧到橡胶管冷凝管末端