基因治疗genetherapy

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1、第11章基因治疗GeneTherapyp498本章内容提示基因治疗(genetherapy)体细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗基因转移方法靶细胞特点、靶细胞种类反义寡核苷酸技术自杀基因与旁观者效应基因治疗（Genetherapy）基因治疗（Genetherapy）：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。一、基因治疗策略策略：直接基因治疗和间接基因治疗1、直接基因治疗：纠正突变基因在原位修复缺陷的基因，

2、以达到治疗目的。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）2、间接疗法：以正常的基因替代致病基因。导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。途径:就基因转移的受体细胞不同，基因治疗有两种途径：1、生殖细胞基因治疗2、体细胞基因治疗1、生殖细胞基因治疗将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为理想的治疗方法，从

3、根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。但还存在某些问题：1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）2．体细胞基因治疗somaticcellgenetherapy将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。措施：（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后，

4、再回输到体内。（2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体上，准确的替换异常基因，是理想的措施。（3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可达到治疗的目的。（4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体细胞。存在的问题对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；随机插入可能引起后代的基因突变。二、基因治疗的方法基因治疗的关键性步骤----目的基因的获得与转移基因治疗首先获得目的基因通常从基因组中分离基因克隆↓定位↓表达↓评价表达情况一）目的基因的获得—正常基因的分离与克隆二）外源基因的转移通过不同方法，将

5、目的基因转移至受体细胞。1）物理方法（1）电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。瞬间细胞细胞膜核膜通透性增加高压脉冲DNA渗入细胞（2）显微注射法（microinjection）利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核例：转基因动物的制备重组基因DNA微注射（体外）小鼠受精卵回植假妊娠仔鼠动物模型：转基因鼠(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)clonesheepDolly体细胞提取

6、核重组细胞回植Dolly卵细胞去核细胞（3）微粒子轰击法利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。2）化学法磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。磷酸钙+DNA→混合微细颗粒↓沉淀反应20~30min↓细胞在沉淀物中暴露5~24h方法简单，但

7、转化效率低。3）脂质体法（liposome）应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构——脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。DNA细胞融合转化细胞PEG仙苔病毒DNA脂膜4）同源重组法同源重组（homologusrecombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。是将外源基因定位导入细胞的染色体上。单交换双交换通过同源重组定点插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正常基因座位带有珠蛋白基

8、因的质粒C重组后，插入外源基因片段带有——neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。5）病毒介导基因内转移（Viralmediatedtransfer）是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞感染细胞重组病毒逆转录病毒(RNA)常用的病毒载体DNA病毒1)逆转录病毒（retrovirus）目前应用最多、最成功.病毒感染细胞后，其基因组RNA经逆转录产生双链DN