akt活化的肿瘤细胞中hif1清除ros的机制分析

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1、优秀毕业论文天津医科大学博十学位论文中文摘要本研究拟明确丝氨酸／苏氨酸蛋白酶(serine／threonineproteinkinase,AKT)活化的肿瘤细胞中缺氧诱导因子．1(Hypoxiainduciblefactor-1，HIF．1)对线粒体氧化呼吸和活性氧(ReactiveOxygenSpecies。ROS)生成的作用，并深入揭示HIF．1对叉头转录因子(forkheadtranscriptionFactor，FOXO)转录因子的调控机制和其他ROS还原剂的作用。通过对上述机制的研究，评估HIF．1抑制剂和ROS诱导剂联合治疗A

2、KT活化的胰腺癌的效果。我们首先观察到在胰腺癌组织中HIF．1的表达与预后相关，其蛋白表达强弱与临床分期及淋巴结转移等正相关，从而验证了HIF．1可能做为新的胰腺癌治疗靶点。AKT的活化可在常氧下引起细胞内HIF．1表达的上调，肿瘤过度生长细胞耐受乏氧时也存在HIF．1的表达增加，因而我们在常氧下对AKT活化的肿瘤细胞中ROS的代谢进行研究，就可以明确HIF．1是否参与ROS的代谢及其机制。利用已建立的过表达质粒载体和干扰慢病毒载体，我们在胰腺癌细胞系Bx．PC3和Mia．Paca2中分别对HIF．1进行过表达和干扰，进而一方面利用流式细

3、胞术测定细胞内ROS含量的变化，另一方面测定HIF．1表达改变后，FOX01及相应ROS还原系列基因的mRNA和蛋白的表达变化，同时采用染色体免疫共沉淀(CHIP)方法了解HIF．1与FOX01启动子的结合方式，并利用双荧光素酶分析启动子功能。我们发现在低表达HIF．1的胰腺癌细胞系Bx．PC3中过表达HIF．1可导致细胞内ROS的减少，而在高表达HIF．1的胰腺癌细胞系Paca-2中干扰HIF．1的表达可导致细胞内的ROS累积。进一步的研究发现HIF．1清除ROS是通过与FOX01启动子区的HRE直接结合从而正调控FOXOI及其下游RO

4、S还原相关酶系的表达来完成，这通过在Bx．PC细胞系中过表达HIF．1载体与FOX01的SiRNA共转染得以验证。在证实HIF．1对细胞内ROS具有清除作用及明确其机制后，我们应用HIF．1抑制剂和ROS诱导剂在体外进行了抗肿瘤治疗的实验研究。2ME为小分子HIF．1抑制剂，已为FDA批准用于临床。As203是常用的ROS诱导剂，已应用于白血病和肝癌的治疗。在体外研究中，我们首先用MTT实验确定二者单独作用于胰腺癌细胞时的IC50，进而利用MTT法确定不同组合比例的两种药物联合使用时的协同指数，通过流式细胞术明确2ME和As203联合可协

5、同促进肿瘤细胞凋亡。为明确二者协同机制，我们分别用流式细胞术测定细胞内ROS含量、流式细胞精品参考文献资料优秀毕业论文天津医科大学博十学位论文术测细胞周期变化以及免疫荧光显像观察2ME单药，As203单药及二者联合用药时细胞内微管结构相应的变化。我们发现MTr法测定的2ME和As203的协同指数约0．2．0．5，因而具有很强的协同作用，联合用药细胞凋亡的比率显著增加。进一步探讨协同机制时我们发现，2ME和As203联合用药时细胞内ROS累积显著高于单药：单药As203虽不能引起明显的周期阻滞，但可显著增强2ME的细胞周期阻滞作用；再次，A

6、s203单药并不能引起微管解聚，但可显著增强2ME的微管解聚作用。综上，HIF．1可作为胰腺癌治疗的新的靶点，由于HIF．1参与细胞内ROS的降解，应用HIF．1抑制剂和ROS诱导剂在体外具有协同抗肿瘤作用。进一步的研究可进行2ME和As203联合治疗的体内试验，还可采用2ME和细胞毒药物组合或者As203与细胞毒药物联合对实体瘤进行治疗的实验研究。关键词：胰腺癌缺氧诱导因子一1活性氧机制协同II精品参考文献资料优秀毕业论文天滓医科大学博十学位论文Abstract111epurpo∞ofthestudyistoinvestigatethe

7、roleofHIF·linregulationofmitochondrialrespiratoryandintracellularreactiveoxygenspeciesincancercellswi廿lAKTactivation,andtoinvestigatetheregulationmechanismofHIF-1ontranscriptionfactorFOXO1andotherROSreductases．Dueunderstandingofabovemechanisms，wefurtherevaluatedtheacti—ca

8、ncereffectofHIF-linhibitor,ROSinducerandtheircombinationincAtncel"Swith黼activatiOnbothinvitroand