应用dna-纳米金探针和基因芯片检测基因突变的分析

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1、包丰硕士学位论文答辩委员会成员名单……姓名名职称称单位位备注注……李利珍珍教授授上海师范大学学主席席{{{陈立侨侨教授授华东师范大学生命科学学院院委员员{{{李J:岂岂副教授授华东师范大学生命科学学院院委员员}}}方燕燕助理研究员员华东师范大学生命科学学院院秘书书}}}}}}}}}}}异中文摘要本文利用纳米技术与基因芯片技术，在制备寡核营酸及蛋白两种生物分子标记纳米金基础上，结合分子生物学和免疫学的方法，建立高灵敏度的核酸检测方法，为分子生物学领域提供了快速、简便、高灵敏度的检测基因突变的新方法。我们采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备纳米金。基于纳米金粒子与疏基修饰的寡核营酸共价结合、与蛋白分子

2、通过吸附作用结合，建立不同生物分子标记纳米金探针的制备方法，并构建三种探针:寡核昔酸纳米金探针、碱性磷酸酶纳米金探针和荧光纳米金探针。通过透射电子显微镜(花M)、紫外吸收光谱对纳米金及纳米金探针进行形貌观察和表征分析;荧光标记法检测纳米金颗粒表面探针覆盖率，并结合纳米金探针的浓度，检测纳米金表面探针标记量。三种不同的纳米金探针分别与靶核酸及基因芯片进行杂交，在芯片上形成“三明治”复合结构。分别采用银染、膜显色及测定荧光三种方法检测基因芯片上的杂交结果，并通过检测信号的强度确定待测核酸的存在，建立了检测核酸的基因芯片银染法，基因芯片膜转印检测法和基因芯片荧光检测法。结果显示，透射电子电镜TEM

3、观察制备的纳米金粒子粒径，大小均匀，直径为13nm;制备的纳米金探针形态完好，分散均匀。荧光标记法检测出纳米金颗粒表面探针标记量，每个纳米金表面大约标记82一83个探针分子。纳米金探针与基因芯片直接杂交并银染检测靶核酸，可检测最低浓度为10一10M的目标核酸分子。基因芯片荧光检测方法通过纳米金表面信号探针与检测探针的比例(5:1)放大检测信号，并将基因芯片上不易测量的杂交结果转为易测的荧光信号，可检测最低浓度为10一12M的目标核酸分子。基因芯片膜转印检测法不需要专门的扫描仪器扫描结果信号，其通过酶催化底物显色，即可在尼龙膜上呈现肉眼可见的颜色斑点，同时也将基因芯片上的杂交结果转移到尼龙膜上

4、，目前，该方法检测灵敏度为10一“M目标核酸分子。研究表明，运用纳米金探针结合基因芯片技术提出的三种核酸检测方法，具有操作简单，时间短，特异性好，灵敏度高，。节约核酸探针用量等特点;通过运用纳米金探针不仅利于杂交反应，而且通过标记不同的标记物，将基因芯片上不易检测的结果信号转为易测信号，为基因突变的检测提供了新的检测方法。关键词:纳米金;探针;寡核普酸;基因芯片;核酸;检测;信号AbstraCtTheDNAdeteetionmethodwasestablishedbasedongoldnanoPartielesilnmobilizedwithDNAProbesandProteinmoleeu

5、les.TheDNAdetectionmethodswillbemorebeneficialfordiagnostieofcaneer，infeetiousdiseasesorotherdiseases.GoldnanoPartieleswerePreParedthroughsodiumcitratereductionofchlorourieacid.ThreekindsofgoldnanoParticleProbes(AuNPs)werePreParedthroughimmobilizationwiththiolated一oligonueleotidesandProteinmolecule

6、s(alkali-nePhosPhatase，AP)resPectively.ThequalityofthePartieleswasmonitoredwithUV一vissPectroscoPyandtransmissioneleetronmieroscoPy(TEM).Thecoverageoftl一eoligonucleotideProbesonthesurfaeeoftheAuNPswasdeterminedbasedonthefluorCSCenCCt.ThesethreekindsofAuNPProbeswereDNAlabeledAnNPProbes，DNAandAPlabele

7、dAnNPPtobes，andCys一DNAlabeledAuNPProbes，resPectively.Throughhybridization，threekindsofsandwiehstruetures(geneehiPs一targetDNA一AuNPPI!Obes)wereformedwiththreekindsofAnNPProbes.Then，silverstaining，membranetran