凝胶层析试验报告

《凝胶层析试验报告》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、摘要凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而乂简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要冇机溶剂，对高分子物质有很高的分离效杲。凝胶色谱法又称分了排阻色谱法。根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。GFC—般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。木实验用凝胶色谱法对食用油屮的甘油三酯进行了分离提取。关键词：凝胶色谱甘油三酯食用油第一章简介凝胶层析法凝胶层析乂称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶屈于惰性载体，不带电荷，

2、吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围卜•进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到Z处。对于高分子物质有很好的分离效果。一、凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上冇显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50,对于小肽和低分了量的物质(1000-5000)的脱盐叩使用SephadexG-10,G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果实验g的是将样品屮一些分子量比较近似的物质

3、进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。二、柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离吋，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在l・5cm范围内，小于lcm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D—般宜在7・10之间，但对移动慢的物质宜在30-40Z间。三、凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸饰水或洗脱液中充

4、分溶胀,溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1・2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架了上，下端流出I」用夹了夹紧，柱顶口J安装一个带冇搅拌装置的较人容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器屮，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表而。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需

5、的流速。在平衡过程中逐渐壇加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色帯出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。四、加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5%・10%。样品浓度与分配系数无关,故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超

6、过1.5・2。样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每-谓份做定性、定量测定。五、凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析而应将抑菌剂除去，以免干•扰洗脱液的测定。如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70%、90%

7、、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90%以上，滤干，再用乙瞇洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到屮性，密封后高压灭菌保存。六、凝胶层析的应用1・脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这-•操作称为脱盐。木法脱盐操作简便、快速、蛋白质和IW类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10>15、25或Bio-Gel-p-2>4、6o柱长与直径之比为5-15,样品体积可达柱床体积的25%・30%,为了防止蛋口质脱盐后溶解度降低会

8、形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸钱等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。2.用于分离提纯：凝胶层析法己广泛用于酶、蛋口质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离捉纯。凝胶对热原冇较强的吸附力，可用来去除无离子水屮的致热原制备注射用水。3•测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析