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1、质粒构建流程一、引物设计1）収得目的基因序列，可选用数据库NCB12）软件分析FI的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。3）选择载体。根据•转染细胞和实骑室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1（+），4）选择酶切位点。对照0的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。5）使用primer5设计目的基因引物，FI的产物应包含从启动子到终止子企部碱基。6）根裾选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端
2、，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。7）引物设计完成，送公司合成。二、目的片段获取1.RNA提取试剂盒：Biotcke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL4DC、漂洗液RW-20°C保存）准备：冰盒、4°C预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA—套操作步骤：1）将lOOOpl裂解液RL加入细胞屮，混合5mino2）加200（.11氣仿混合，震荡15s，室温孵育3min。3）4°C,12000rpm离心lOmin。4）最上层水相转移至新EP管巾（体积约550Ml）5）加入1倍体积（550gl）70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱R
3、A屮，4°C,lOOOOrpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500pl去蛋白液RE，12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700pl去漂洗液RW，12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500Ml去漂洗液RW,12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50glRNasefreewater于膜上，室温放貫2min12)4°C,12000rpm离心60s13)点样：5plRNA+lpl10Xbuffer,1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min,可见3条亮带。1
4、4)-20°C保存2.RNA反转录试剂盒：TaKaRapriincscriptRTreagentkitwithgDNAeraser（-20°C保存）准备：冰盒，②④⑤⑥取山解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：1）基因组DNA去除（10pl体系）②5XgDNAeraserbuffer2pi①gDNAeraserlglTotalRNA4jJ（可根据RNA浓度调整）©RNasefreewaterPCR仪中进行，程序：42°C,2min->4cC注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20pl体系）④5XprimerScri
5、ptbuffer24gl②primerScriptRTenzymemixI1pi⑤RTprimermix1pi⑥RNasefreewater4}.il1）反应液10ulPCR仪：37°C,15min^85°C,5s^4°C注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液屮3）1.5mlEP管收集,-2CTC长期保存3.PCR扩增高保真酶primerstar扩增，50（il体系如•卜5XPSbuffer10glPCR程序:dNTP4pl95°C5min1dH2O32.5gl95°C30sIPrimerstar0.5gl56°C30sJ35cyclecDNAi
6、y（可变）72°ClminR-primerlpl72°ClOminF-primerlul注：可根据不同基因调节返货温度，延伸时间，循环数。点样：5（11?€尺产物+1（_116乂1）1^0'，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V,15min4.PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microelutecycle-purespinprotocol（OMEGAbio-tek）D6293-01①将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积bufferCP,混匀。②转移至HiBindMicroElutionDNA柱（套收集管），室温离心100
7、00g，lmin。③弃废液，At）700glDNAwashbuffer（含乙醇）到柱子，室温离心10000g，Imino④弃废液，重复③⑤弃废液，空管离心13000g,lmin⑥柱子放入新EP宵，加10-20plElutionbuffer到膜上，室温孵育3-5min,离心10000g,lmin⑦电泳检测2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）①将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5mlEP管。②加等体积（lg=lml）bindingbuffer（XP2）,60°C金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min③溶液加入离心柱，离心100
8、00g,lmin,废液倒冋再离一次④弃废液，加3OOplbindi
