瓜蒌trichosantheskirilowii等中草药纤溶酶的筛选 分离纯化与cdna克隆

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1、摘要活血化瘀中草药具有“通利血脉，促进血行，消散瘀血”等主要作用，现代药理学研究也证明了活血化瘀中草药可以改善血液的血流动力学、血液流变学和微循环．目前已经从多种生物体内分离出来了能有效治疗血栓性疾病的纤溶酶，多属于丝氨酸蛋白酶类．本文的研究目的是筛选出具有纤溶酶活性的中草药品种，并对其进行分离和性质鉴定．首先选取瓜萎等42种在临床上具有活血化瘀作用的中草药，水浸提物经硫酸铵沉淀得到蛋白质提取物，利用纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性，筛选具有纤溶酶活性的中草药品种．结果表明，瓜萎、稀莶草、望江南、延胡索、

2、益母草，竹节三七、牛膝、泽泻的蛋白质提取物具有明显的体外纤溶酶活性。将其中的牛膝、稀莶草水浸提物通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析分离，得到的牛膝40％-4、稀莶草60％-1、稀莶草60％-2、稀莶草00％-3和稀莶草80％-2组分具有较高的纤溶酶比活力．利用蛋白酶抑制剂对益母草纤溶酶提取物进行处理，结果表明，苯甲基磺酰氟、大豆胰蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶抑制剂、苯甲脒能完全抑制益母草纤溶酶活性，EDTA、胃抑肽素、亮抑肽素、抑肽酶有部分抑制作用．认为益母草纤溶酶属于丝氨酸蛋白酶

3、类．利用苯甲脒为配基、环氧氯丙烷活化的Sepharose4B为载体，制备亲和层析分离介质．对益母草纤溶酶提取物进行亲和层析分离，得到具有纤溶酶活性、表观分子量分别为60kD和33kD的蛋白质组分。纤维蛋白平板、Fibrin．PAGE检测，新鲜瓜蒌蛋白提取物及瓜萎蛋白提取物均具有纤溶酶活性。蛋白酶抑制剂实验表明，PMSF、大豆胰蛋白酶抑制剂可以完全抑制瓜蒌纤溶酶的活性，苯甲脒、鸡卵类粘蛋白有一定的抑制作用，说明瓜蒌纤溶酶属于丝氨酸蛋白酶类。用不同的蛋白质作为作用底物，发现瓜蒌纤溶酶提取物能够有效降解纤维

4、蛋白原和纤维蛋白，而对牛血清白蛋白、牛血红蛋白、人免疫球蛋白基本无降解作用，表明该纤溶酶提取物毒副作用小。激活活性实验表明．瓜萎纤溶酶的纤溶酶原激活活性明显高于其直接溶纤的活性，属于纤溶酶原激活剂．利用人工合成底物BAEE测定瓜蒌纤溶酶提取物，表明该物质具有胰蛋白酶活性，分析认为瓜萎纤溶酶是将纤溶酶原中Ar9557-lle55s键断裂，产生了纤溶酶．由于大豆胰蛋白酶抑制剂对瓜蒌纤溶酶的活性完全抑制，因此选用大豆胰蛋白酶抑制剂为配基，以环氧氯丙烷活化的Sepharose4B为载体制备亲和层析介质，利用亲

5、和层析对新鲜瓜萎蛋白提取物进行了分离。得到了两个具有活性的、表观分子量分别为67kD和55kD的蛋白酶组分。瓜蒌纤溶酶提取物经DEAE-Sepharose和CM．Sepharcee离子交换，分离出了表观分子量为62．5kD的蛋白质组分(7kl'一I)，其比活力为109．81U／rag，样品纯化了3．58倍。利用植物丝氨酸蛋白酶N．末端序列，以及通过对植物丝氨酸蛋白酶的同源蛋白多重序列的比对，利用保守序列的氨基酸设计兼并引物，采用RT-PCR方法，扩增得到瓜蒌部分基因序列。关键词：中草药；瓜萎：纤溶酶；

6、筛选；分离纯化；eDNA克隆Screening,IsolationandeDNACloningofFibrinolytleEnzymefromTdchosantheskldlowliandsomeChineseHerbalMedicine0Author：ZⅡoUYan-fenSupervisor：ProfessorZHUBae-ehengbhjor：BotanyAbstractModempharmacologyhadprovedthatChineseherbalmedicineswhichhadthe

7、effect。of枷vanllgbloodandremovingstasiscouldimprovehemodynamies，hemorheologyandmicrocirculationofblood．FibrinolyticellzyInewhich咖beusefulintreatingsolneformsofthrombosis,hasbeenisolatedandpurifiedfromanimals,microorganismandseveralChineseherbalmedicin嚣．a

8、ndmostofthembelongtoscrineprotease．Thisdissertationwasfocused011thestudiesonscreeningandisolation$omeChin雠hca。oalmedicineswithfibrinolytieactivity,andthencDNAcloneoffibrinolyticenzymefromTrichosantheskirilowii．Proteinswet-eextrac