spink1慢病毒过表达载体和其稳转aspc-1细胞株的构建及其对人胰腺癌细胞增殖的影响

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1、目录一、摘要．．1(一)中文摘要．1(二)英文摘要4二、正文．7(一)前言(一)日U吾／7(二)材料与方法91．材料．92．方法12(三)结果。23(四)讨论31(五)结论36(六)参考文献．．37三、综述．．41(一)综述．．41(二)参考文献48四、攻读学位期间发表文章情况．54五、致谢．55万方数据大连医科大学硕士学位论文SPINKl慢病毒过表达载体和其稳转AsPC一1细胞株的构建及其对人胰腺癌细胞增殖的影响硕士研究生：张婧指导教师：王军副教授专业名称：病理学与病理生理学摘要目的：丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazall型(serin

2、eproteaseinhibitorKazaltype1，SPINKl)是Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子家族中主要的成员之一，其在人体诸多的生理和病理过程中发挥着重要的作用。SPINKl具有胰蛋白酶抑制因子、类似生长因子和自噬的负调节因子等多重生物学功能。在胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌和结肠癌等多种癌症组织中均可检测到SPINKl的表达，有研究发现SPINKl能促进前列腺癌和结直肠癌细胞的增殖，但其是否能促进某些类型肿瘤细胞(如胰腺癌细胞)的增殖尚存在争议，而且其中的作用机制至今仍不清楚。本课题的目的是设计并制作包含人SPINKl

3、基因的完整编码区序列的慢病毒过表达载体，用此载体感染人胰腺癌AsPC．1细胞，并建立SPINKl过表达的稳转AsPC．1细胞株，以此来探索此基因在胰腺癌细胞中是否具有促进肿瘤细胞增殖和克隆形成的能力，并为今后进一步的研究奠定基础。方法：首先构建SPINKl慢病毒过表达载体，包装病毒并产生病毒颗粒。应用PCR方法扩增SPINKl基因的全部编码序列，经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后切胶回收DNA，将其与慢病毒载体(pLenti．CMV一2A．GFP)同时用限制性内切酶酶切后，用T4DNA连接酶进行连接，将构建好的人SPINKl慢病毒过表达载体

4、(pLenti-CMV．hSPINKl．2A．GFP)进行转化，提取DNA进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳和基因测序进行鉴定。用已鉴定正确的SPINKl慢病毒过表达载体和慢病毒包装混合质粒共转染293T细胞产生病毒颗粒，过滤并高速离心浓缩病毒1万方数据大连医科大学硕士学位论文颗粒。然后用此病毒颗粒感染并建立SPINKl过表达稳转AsPC．1细胞株，使用嘌呤霉素(2ug／m1)药物筛选病毒感染后的阳性克隆并扩增，培养成SPINKl过表达稳转AsPC．1细胞株。通过实时荧光定量PCR(Real-timePCR)和WesternBlot的方

5、法检测病毒感染后SPINKl基因在mRNA水平与蛋白水平上的表达变化。最后用CCK．8法、台盼蓝染色法、流式细胞仪检测SPlNKl基因对人胰腺癌AsPC．1细胞增殖能力的影响，并通过平板细胞克隆形成实验来检测SPINKl基因对人胰腺癌AsPC．1细胞克隆形成能力的影响。结果：经酶切、琼脂糖凝胶电泳实验和基因测序鉴定，证实SPINKl慢病毒过表达载体(pLenti．CMV．hSPINKl．2A．GFP)构建正确。SPINKl慢病毒过表达载体和慢病毒包装混合质粒共转染293T细胞后，在荧光显微镜下可观察到许多绿色荧光点，并伴有漂浮细胞和

6、破裂细胞，感染效率可达90％。用慢病毒颗粒感染AsPC．1细胞，经嘌呤霉素药物筛选出阳性克隆，将阳性克隆连续培养扩增数代后经Real．timePCR和WesternBlot的方法检测，SPINKl基因可在AsPC．1细胞中稳定高效地表达，与阴性对照相比病毒感染后的SPINKl基因在mRNA水平与蛋白水平上的表达量分别上调了25倍和5倍。在CCK．8实验中，SPINKl过表达AsPC．1细胞的光密度值为1．4OD，对照组细胞的光密度值为1．0OD，差异有统计学意义(P<0．001)；台盼蓝染色检测细胞活性的实验发现，SPINKl过表达

7、AsPC．1细胞的活性为(93．30±0．40)％，对照组细胞活性为(71．97±0．78)％，差异有统计学意义(P

8、统计学意义(P