rna抽提实战经验总结

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1、RNA抽提实战经验总结（一）对人部分实验人员来说，RNA抽提比基因组DNA抽提要困难得多。事实上，现有的RNA抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提RNA，比抽提基因组DNA更方便，成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织RNA的抽提，总会碰到问题呢？组织RNA抽提失败的两人现象是：RNA降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞屮抽提RNA不容易降解。现有的RNA抽提试剂，都含有快速抑制Rnase的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。细胞被裂解后，裂

2、解液屮的有效成分立即抑制住细胞内的Rnase,所以RNA得以保持完整。也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以JtRNA不容易被降解；反过来讲，组织中的RNAZ所以容易被降解,是因为组织小的细胞不容易迅速少裂解液充分接触所致。因此，假定有一种办法，在抑制RNA活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。液氮研辭就是授有效的这样一种办法。但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产纶了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆辭方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制Rnase活性这

3、个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase降解RNA的速度快。电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较羌，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原來用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎100%能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。总Z,如果出现降解现彖或者组织内杂质残留现彖，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买-•些血/鸡之类的小动物，収和应部分

4、的材料用于RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白质。究竟怎样才能确保RNA抽提的成功率呢？实验前选择合适的方法/试剂，这是最重要的一步；好的方法/试剂在确保成功的同时，操作方便，经济实用。当然，您的选择可能仍然有问题，这就需要能正确分析实验失败的原因，以便改进。实验前方法/试剂的选择0：抽提RNA的口的RNA用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对猶反应抑制物残留耍求严格。投入

5、决定产出：每次都以获得最高纯度的RNA为目的，劳民伤财。1：样品的收集/保存・影响降解的因索样晶离开活体/或者原来的纶长环境后，样品中的内源酶即会开始降解RNA,降解速度与内源酶含虽及温度冇关。传统上，只冇两个办法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。JTi者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并•口较容易匀浆的组织。貝体地讲，植物组织、肝脏、胸腺、胰腺、脾脏、脑、脂肪、肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来,再往下做。2：样品的破碎及匀浆---影

6、响降解和得率的因素样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使RNA彻底完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的陆破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的纽织可以在裂解液屮通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程;植物组织、肝脏、胸腺、胰腺、脾脏、脑、脂肪、01肉组织等样品，它们不是内源酶含最高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨,最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因

7、为冷冻后内源酶更容易起作用。3：裂解液的选择・-一影响操作方便程度，内源杂质残留的因素常用的裂解液儿乎都能抑制Rnase活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源猶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源陋的能力。4：纯化方法的选择……影响内源杂质残留，抽捉速度的因索对于干净的样品，如细胞，手边的儿乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物、肝脏、细菌等杂质含虽:很高的样品，选择合适的纯化方法是至关垂要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能冇效去除影响RNA后续酶反应的杂

8、质，但价格较贵；使川经济而经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。RNA抽提的“三人纪律八项注意”纪律一：杜绝外源酶的污染。注意一：严格戴好口罩、手套。注意二：实验所涉及的离心管、Tip头、移液器杆、电泳杷、实验台面等