酵母菌课程论文

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1、酵母工程菌的构建过程及在食品中的应用1.3.3食品级酵母表达系统的构建酿酒酵母在食品_F业中的应用已有数千年历史，它也是最早发展起来用于表达异源蛋白的真核基因表达系统。利用酿酒酵母表达系统已经成功的生产出了商品化的疫苗、重组酶等。对酵母的分子生物学改造包括加强酵母对淀粉的利用、构建低双乙駄、低HZS和低高级醇的酵母工程菌、提高酵母絮凝性、增加啤酒泡沫稳定性、增加酵母发酵啤酒后的生香物质等。然而，虽然酵母工程菌在现代食品工业中的应用越来越广一泛，关于—〔程菌的安全性也越来越受到了消费者的质疑。很多在实验室构建的酵母工程菌存在各种各样的安全和使用隐患，主要体

2、现在酵母所使用的选择标记和酵母宿主本身两个方面。酿酒酵母的选择标记主要有营养缺陷型和显性选择标记，但是这两种选择标记在食品发酵工业中的应用都各有缺陷。使用营养缺陷性状标记需要先构建营养缺陷型单倍体酵母。与多倍体工业菌株相比，单倍体酵母生长缓慢、难以高密度发酵.生长过程中性状不稳定容易发生突变和衰退，因此并不适合用来生产发酵食品或者发酵型饮料。抗生素和重金属选择标记虽然适合工业酵母菌株，但是这两种选择标记都不安全，所以也不适合在食品工业中使用。基于以上种种原因，构建食品级的酿酒酵母表达系统非常必要。目前关于构建食品级酵母表达系统的研究相对较少。Yapl基因

3、是很多酵母基因组内相对保守的一种转录因子，属于激活保护酵母在压力下生长的基因，Iwakiri等(2005)基于肠pl基因构建了假丝酵母食品级表达系统。使用来自假丝酵母本身的Yapl基因做为选择标记，将包含此标记的载体转入酵母后得到的转化子可以在含4林留ml以上浓度的放线菌酮的培养基上生长(Iwakirieta12005)o虽然Iwakiri所使用的选择标记是来自假丝酵母本身，但是由于在筛选时用了放线菌酮，因此也不能说是完全意义上的食品级选择标记。要构建一种普适性的食品级基因〔程表达系统，就必须找到一种在野生型食品级安全微生物中一般不存在、同时本身又安全且

4、筛选简便的标记。由于商业用的酿酒酵母几乎都无法利用蜜二糖(LiIjestrom一因此酿酒酵母对蜜Suomineneza乙1988:Gasent一Ramirezeral.1995)二糖的发酵能力可以被用做食品级的筛选标记。蜜二糖能够被a—半乳糖普酶(EC32.1・22)分解为半乳糖和葡萄糖，含有a一半乳糖首酶的酵母阳性克隆能在以蜜二糖为唯一碳源的培养基上生长，且能够在含a—半乳糖普类寡糖类似物X—a—gal的平板上形成蓝色菌落，筛选非常简便。为了提高从糖蜜产乙醇的产量或者以糖蜜为培养基生长的酵母的生物量,a一半乳糖营酶已经在很多的酿酒酵母中得到表达(Seh

5、reuderelai.1993;GasentRamirezelai.1995;Sehreudereza1.1996ShibuyaeIa乙1998;Shibuyaezaz,1999:ehiba.2a乙2002)。在酵母双杂交系统中a一半乳糖首酶曾被用作选择标记(MeIchereza1.2000)o已经有以a—半乳糖首酶为筛选标记构建食品级Str印zocoeeusrherm即hilus和LacroeoecusIaetI.s基因工程表达系统的报道(Boueherelal.2002;Jeongeral.2006;Labrieezal.2005)。目前尚未见到以a

6、一半乳糖首酶为筛选标记构建食品级酵母表达系统的报道。下面简单介绍一下a一半乳糖营酶的性质、特点和应用。1.3.3.la一半乳糖普酶的性质和特点a一半乳糖营酶是一种外切酶，不同来源的a—半乳糖首酶分子量介于28kD—37k-D之间，有单聚体、二聚体、三聚体和四聚体四种存在形式。根据可利用底物的特异性，a—半乳糖营酶可以被分为两类:一类能分解低分子量的a一半乳糖普比如PNPGaI和如蜜二糖和棉籽糖等寡糖类底物；另一类主要是能特异性分解半乳甘露聚糖，并同时能不同程度水解低分子量的底物(shibuyaetal1998)oa-半乳糖普酶的作用方式是断裂非还原性末端

7、的a—D—半乳糖营键，产生一分子的a一半乳糖，但在90年代以来的研究表明，有些微生物的a一半乳糖普酶还能水解其侧链基团是通过a—半乳糖普键连接的杂多糖。a一半乳糖普酶是一种糖基化酶，其蛋白质和糖普的连接方式是通过低聚糖中的乙駄葡萄糖胺和蛋白质中的天冬氨酸相连接。酵母a—半乳糖营酶的多肚链上有9个左右的糖基化位点(LiIjestrom一Suomineneta1.1988),正确的糖基化对维持a一半乳糖普酶的活性与稳定性及其对a—半乳糖普特异底物的亲和性具有非常重要的作用。微生物合成的a一半乳糖营酶皆为诱导酶，一般的诱导物是酶作用的底物或底物类似物，如蜜二糖

8、、棉籽糖和X—a—ga!等，有时还可能是a—半乳糖营的分解产物如半乳糖(李孝辉等