外源性α晶体蛋白作用于视网膜神经节细胞的定位研究

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1、外源性α晶体蛋白作用于视网膜神经节细胞的定位研究王兴利马强曾玉晓何建荣王一（第三军医大学西南眼科医院重庆400038）摘要目的观察外源性α晶体蛋白与视网膜神经节细胞(retinalganglioncells,RGCs)的结合部位。方法对外源性的α晶体蛋白进行生物素化后与原代培养的RGCs共孵育，再与荧光标记的亲和素进行反应，于激光共聚焦显微镜下观察外源性α晶体与RGCs的结合部位。　结果外源性的α晶体蛋白特异性的结合在RGCs细胞膜上。结论外源性α晶体蛋白是通过与RGCs细胞膜特异性相结合而发挥相应的生物学功能，但其结合

2、方式及作用机制需进一步研究。关键词：α晶体蛋白生物素化视网膜神经节细胞定位positioningtheexogenousα-crystallininretinalganglioncellsWANGXing-li,MAQiang,ZENGYu-xiao,HEJian-rong,WANGYi(DepartmentofOphthalmology,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)朗读显示对应的拉丁字符的拼音Abstrac

3、tObjectiveToidentifythesiteofretinalganglioncells(RGC)thattheexogenousα-crystallinbindto.MethodsBiotinylatedtheexogenousα-crystallinandincubatedwithprimaryculturedRGCs,thenreacttofluorescentlylabeledavidin,toobservethebindingsiteofexogenousα-crystallininthelaserc

4、onfocalmicroscope.Resultsexogenousα-crystallinspecificbindtothemembraneofRGCs.ConclusionExogenousα-crystallinthroughbindingthemembraneofRGCstoplaythecorrespondingbiologicalfunction,butitsbindingmodeandmechanismneedfurtherstudies.Keywords:α-crystallinBiotinylatedr

5、etinalganglioncellspositionSupportedbytheGeneralProgramof NationalNaturalScienceFoundationofChina.Correspondingauthor:WangYi,Tel:(023)68765377,E-mail:wangyieye@yahoo.com.cn视神经损伤后的治疗一直是眼科的难题，迄今仍缺乏有效的治疗手段。因此，视神经损伤后保护RGCs存活和促进其轴突再生已成为当前国内外研究的热点。2000年，Fischer等[1]发现晶状

6、体损伤后能显著促进RGCs的存活和轴突再生,其原因可能与晶状体含内源性保护物质有关。经进一步研究证实，这种保护性物质为晶状体内的α和β晶体蛋白，而α晶体蛋白的作用更为显著[2-3]。并且，当α晶体蛋白与RGCs共孵育后，用α晶体蛋白抗体进行免疫染色，发现α晶体蛋白结合于RGCs细胞膜上[4]。但随后的研究发现，RGCs细胞有内源性α晶体蛋白的表达[5]。因此，我们对此前的研究结果提出质疑：RGCs细胞膜上检测到的α晶体蛋白是不是包含有内源性？或者仅仅是内源性而外源性根本没与RGCs细胞膜结合？由此，我们对外源性α晶体蛋白

7、进行生物素化标记后与RGCs共孵育，旨在明确外源性α晶体蛋白是否与RGCs结合以及结合的部位，初步探讨外源性α晶体蛋白保护RGCs存活和轴突再生的作用机制。1　材料与方法1.1　主要试剂和仪器α晶体蛋白(sigma公司)；活化生物素（博奥森公司）；基础培养基干粉DMEM/F12(1∶1)；标准胎牛血清(天津TBD公司)；0.125%胰蛋白酶(Anresco公司)；抗大鼠的thy1.1抗体(BD公司)；山羊抗大鼠cy3（abcam公司）；cy3荧光亲和素（博奥森公司）；HRP标记的亲和素（博奥森公司）；胰岛素（博奥森公司）

8、；TMB显色剂（博奥森公司）；EZ-LinkNHS-LC-LC-Biotin（Pierce公司）；Zeba™离心式脱盐柱（Pierce公司）；荧光显微镜(德国Leica公司)；激光共聚焦显微镜及图像分析系统(德国Leica公司)；Lambda分光光度计（美国PerkinElmer公司）；手术显微镜(日本Olympus