缺氧诱导胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成体外初步研究

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1、关于本论文学术方面的意见：1、本文为描述新研究，新意不够；2、建议补充蛋白的生物学功能或动物实验资料。修改说明：本研究旨在说明缺氧可以诱导分化期胶质瘤细胞发生逆分化形成肿瘤干样细胞。我们经过磁珠分选得到CD133-细胞群，然后对该细胞群进行缺氧培养。采用单细胞成球（缺氧成球能力明显强于常氧培养组），免疫荧光、RT-PCR、Westernbloting检测了肿瘤干细胞标记蛋白（SOX-2、OCT-4、KLF-4、Nanog、CD133），结果显示缺氧组均高表达，并通过流式细胞仪证明缺氧培养后CD133+细胞数比例逐渐增高。为了验证此理论的正确性，我们还通过细胞周期及凋亡予以验证，结果表

2、明，缺氧培养CD133-细胞群后细胞周期阻滞于G0/G1期，同时抗凋亡能力也明显强于常氧培养组，这些特性也符合了胶质瘤干细胞特性。因此，我们采用上述方法予以证明缺氧可以诱导胶质瘤细胞逆分化形成肿瘤干样细胞。本研究结果可以很好解释胶质瘤术后为何高复发，并为高压氧治疗胶质瘤提供另一科学依据。同时，本研究也证明了胶质瘤干细胞除了来源于正常神经干细胞突变外，胶质瘤细胞发生逆分化形成胶质瘤干样细胞也可能是其来源的重要途径之一。缺氧诱导胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成体外初步研究汪攀，赵秀文，兰川，吴南（400038重庆，第三军医大学西南医院神经外科）[摘要]目的通过体外研究初步探讨缺氧可以诱导胶质瘤

3、细胞逆分化形成肿瘤干样细胞。方法（1）采用CD133+细胞免疫磁珠分选法分离胶质瘤细胞得到CD133-细胞群。（2）将CD133-U87、GL261细胞系制成单细胞悬液并种植一个细胞于96孔板内，分别行缺氧及常氧培养，观察单细胞生长情况。（3）缺氧处理CD133-细胞48小时后行免疫荧光染色鉴定肿瘤干细胞样标记蛋白（SOX2，OCT-4，KLF-4，Nanog，CD133）表达情况，并分别缺氧处理0、3、6、9、12、24h及0、12、24、48、72h行qRT-PCR及Westernblot检测。流式细胞仪检测胶质瘤细胞缺氧培养后CD133+细胞比例变化，检测时间为缺氧培养1、3、

4、5、7天。（4）缺氧处理胶质瘤细胞1、3、5、7天后流式分析细胞周期及凋亡改变。结果1.单个CD133-胶质瘤细胞缺氧培养后呈悬浮球样生长，常氧培养仍为单个死亡细胞，即缺氧培养组成球率明显高于对照组（P≤0.001）。2.荧光检测结果表明,肿瘤干细胞样标记蛋白在CD133-胶质瘤细胞缺氧处理48h后高表达；qRT-PCR及Westernblot检测结果表明，缺氧处理胶质瘤细胞可以明显上调肿瘤干细胞样蛋白表达（P<0.05）,其中qRT-PCR显示SOX-2，OCT-4及Nanog最高表达在缺氧后9h，KLF-4及CD133在缺氧后12h表达最高。Westernblot蛋白检测显示OC

5、T-4最高表达在缺氧后12h，CD133表达最高在缺氧24h后，KLF-4及Nanog最高表达则在缺氧48h后，SOX-2在缺氧72h后表达量最高。另外随着缺氧时间的延长，CD133+细胞数比例逐渐升高（P<0.05）。3.细胞周期结果提示缺氧处理肿瘤细胞后，G0/G1期延长，G2/M+S缩短（P<0.05）；凋亡结果提示常氧培养组更易凋亡（P<0.05）。结论缺氧可以诱导CD133-胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成。[关键词]缺氧；胶质瘤；肿瘤干样细胞；Cancerstem-likecellscanbeinducedunderhypoxiaconditionsingliomacellsW

6、angPan,ZhaoXiuwen,LanChuan,WuNan(DepartmentofNeurosurgery,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400038,China）[Abstract]ObjectiveToexplorewhethercancerstem-likecellscanbeinducedunderhypoxiaconditionsingliomacells.MethodsU87,GL261andPrimarygliomacellswereculturedinDMEM/F12+10

7、%FBSandCD133-cellsweresortedthroughmagnetic-activatedcellsorting(MACS).SingleCD133-cellwastransferredto96-wellplates(n=6)containing170μlserumfreeDMEM/F12medium.Threeofthemwereculturedin1%O2,andothersin21%O2for21days;at0,3,7,14or21