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时间:2019-01-09
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1、云南龙竹种子外植体适宜灭菌时间筛选试验 摘要以云南龙竹的成熟种子为试验材料,采用75%酒精配合0.01%升汞作消毒灭菌剂,并设置0.01%升汞的不同消毒灭菌时间处理的对比。结果表明:在用75%酒精处理15s后,再用0.01%升汞消毒灭菌处理,其适宜的消毒灭菌处理时间为3h。在此消毒灭菌时间处理情况下,龙竹种子外植体的污染率已较低,为16.7%;而发芽率仍较高,可达到72.0%。 关键词云南龙竹;组织培养;种子;外植体;灭菌 中图分类号S795文献标识码A文章编号1007-5739(2016)06-0159-01 竹子因开花周期较长,且开花花期无法预测,种子
2、获取十分困难。因此,采用组织培养技术,对竹子进行快速扩繁,是目前解决竹子种苗繁殖效率低问题的有效方法之一。在组织培养过程中,菌类污染是培养过程中常见且必须高度重视的问题,其污染来源一般可分为3类:第1类是材料带菌,第2类是接种污染,第3类是培养过程污染[1]。因而植物组织培养技术的基础是获得无菌材料,即有效解决材料带菌问题,理论上污染率应该控制在8%以内,但实际操作过程中,一般污染率会达到20%左右,甚至更高。再者,竹类植物与其他植物相比,竹子外植体的消毒灭菌则更困难,很难达到理想的灭菌效果,这可能与它的外在形态结构有关[2]。外植体表面消毒灭菌的关键就是要选择合
3、适的消毒剂和消毒时间,同时还要兼顾消毒灭菌后外植体材料的存活率、生长状况等[3]。5 很多学者对于竹子外植体的灭菌普遍采用的方式是以酒精(75%)与升汞(0.05%~0.20%)或次氯酸钠(0.5%~2.0%)配合使用,然后再根据不同的外植体材料情况进行不同时间的灭菌[4]。本试验以云南师范大学竹类研究所提供的云南龙竹(DendrocalamusyunnanicusHsuchetD.Z.Li)种子为外植体材料,以MS培养基添加1mg/L6-BA为起始培养基,进行了酒精(75%)配合升汞不同消毒灭菌时间的比较,以期从中筛选出较适宜龙竹种子外植体的消毒灭菌方法。
4、1材料与方法 1.1试验材料 选取成熟度和饱满程度较高的云南龙竹健康种子(此种子已干燥储藏超过1年),仔细筛选去除发黑、发霉和结构不完整的种子,剥去外壳且不能伤及胚芽部分,最后留下色泽较好、颗粒饱满且结构完整的种粒备用。 1.2试验方法 把选好的种粒用75%酒精消毒15s并用无菌水清洗后,再用0.01%升汞浸泡做不同时间的消毒灭菌处理。所设置的4个不同处理时间分别为2.0、2.5、3.0、3.5h。处理结束后,分别用无菌水振荡清洗4~5次,每次5~7min,分别记为处理1、2、3、4。用无菌滤纸吸干种粒上的水分,分别接种到MS+1mg/L6-BA+5g/L
5、琼脂粉+30g/L蔗糖培养基中。每处理接种6组,每组5个试管,每试管接种1粒种子,共计30粒种子,置于23~25℃、光照2000lx、光照时间12h/d条件下培养[5-6]。 观察记载各处理的种子在接种5、10、15、20d后的污染情况和发芽情况,并对其15d时的污染情况和20d时的发芽情况进行统计分析。5 2结果与分析 2.1升汞不同消毒灭菌时间处理种子的污染情况 由表1可知,接种15d后,处理1、2、3、4的污染数分别为2.00、1.67、0.83、0.50粒。经方差(新复极差法)分析,处理1、2、3、4之间的差异极显著,而组间(重复间)差异不显著。进
6、一步的多重比较分析结果(表2)表明,处理1与处理3、4差异都极显著,而与处理2无显著差异;处理2与处理4差异极显著,与处理3差异显著;处理3和处理4差异不显著。结合各处理的污染率可得出,随着消毒时间的增加,其污染程度越来越低,至处理3、4时,污染程度已较低且二者已无显著差异。 2.2升汞消毒时间对竹子种子外植体发芽情况的影响 由表3可知,接种20d后,处理1、2、3、4的发芽率分别为94.4%、95.0%、72.0%、44.4%,即随着升汞消毒灭菌时间的增加,各处理的发芽率呈现先增加后降低的趋势,最高达(下转第165页) 95.0%,最低为44.4%。方差分
7、析结果显示,处理2与处理4差异极显著;处理1、3与处理4差异显著;而处理1、2、3之间差异不显著。 3结论与讨论 本试验以云南龙竹的成熟种子为试验材料,采用75%酒精配合0.01%升汞作消毒灭菌剂,并设置0.01%升汞的不同消毒灭菌时间处理的对比。试验结果表明:在用75%酒精处理15s后,再用0.01%升汞消毒灭菌处理,随着0.01%升汞消毒灭菌处理时间的增加,各处理的污染率显著降低,而剩余(未污染)种子的发芽率则呈现先升高后又降低的趋势。分析表明,用0.01%升汞对云南龙竹种子进行消毒灭菌处理,其适宜的处理时间为35h。在此消毒灭菌时间处理情况下,龙竹种子外
8、植体的污染
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