何首乌不定根离体诱导和悬浮培养探究

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1、何首乌不定根离体诱导和悬浮培养探究［摘要］通过离体不定根的高效诱导与悬浮培养，实现何首乌资源的永续利用。在培养基中添加不同浓度的蔗糖和植物生长物质，筛选从幼茎有效诱导不定根的最适培养基；采用正交试验筛选不定根悬浮培养的最适培养基；对悬浮培养的不定根进行继代培养并测定生长曲线，同时对不定根中的主要有效成分进行检测。结果表明，能够从幼茎有效诱导不定根的最适培养基为MS+蔗糖40g-L-1+a-M乙酸2.0mg•L-1+6-卞基腺11票吟0.2mg•L-1；不定根悬浮培养的最适培养基为MS+蔗糖30g•L-1+a-M乙酸2.0mg•LT+生根粉0.2mg

2、•L-1；经过检测，发现不定根同样含有何首乌药材中的主要有效成分二苯乙烯昔。该实验实现了何首乌不定根的高效诱导与培养，为中药资源的永续利用研究提供了工作基础。［关键词］何首乌；不定根；离体诱导；悬浮培养［稿件编号］2013-05-01［基金项目］国家''重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09301-005-03-03)；安徽省高等学校自然科学研究重点项目(KJ2011A191)［通信作者］黄璐琦，Tel:(010)64014411-2955,E-mai1:huangluqi@263・net何首乌PolygonummultiflorumThun

3、b.系蓼科Polygonaceae蓼属Polygonum多年生缠绕草本，全株皆可入药［1］。其块根为常用大宗传统中药何首乌，又称首乌，生用解毒、消痈、润肠通便，制后能补肝肾、益精血、乌须发、壮筋骨［2］。现代研究发现，何首乌含有多种化学成分，如二苯乙烯昔类、蔥醍类和磷脂类化合物等，具有保肝、抗癌、抗衰老、提高免疫力、抗炎、益智、舒张血管和抗诱变等多种药理活性［3］,其中二苯乙烯昔是其具抗衰老、降低胆固醇、提高免疫功能、防止动脉硬化等作用的主要有效成分⑷。近年来，伴随世界范围内回归自然的潮流及人们生活水平的提高，对天然植物药的需求量剧增，何首乌的市场

4、需求日益增加。然而，何首乌的野生资源有限，多年滥采滥挖，不但产地资源遭到破坏，而且其生长环境受到影响，野生资源面临匮乏的危险［5］。建立人工种植生产基地，对缓解和保护野生资源而言意义重大。但是人工栽培品在长期栽培过程中，品种退化混杂严重，高产质优的遗传稳定性难以保持，大大影响了药材的质量和产量。鉴于此，本文根据何首乌离体培养的生长特性，在组织培养生物技术的基础上，以试管苗幼茎为外植体，进行不定根的高效诱导、悬浮培养及成分分析，以期为何首乌野生植物资源的替代来源研究及有效成分获取提供科学依据，为后续的产业化开发研究奠定基础。1材料原植物采自安徽潜山，

5、经中国药科大学中药生物技术教研室鉴定为何首乌P.multiflorum0消毒处理后剥取顶芽分生组织，在培养基MS+6-卞基腺嚓吟（6-BA）2.0mg-L-1+13引噪乙酸（IAA）0.2mg•L-1上建立无菌培养体系以获得丛生芽较多，正常生长的试管苗。取其无菌幼茎作为供试材料。2方法2.1不定根诱导培养基筛选2.1.1正交试验设计切取试管苗幼茎，在无菌条件下用刀片纵向切割3刀，接种于培养基上。按L9（34）正交表设计实验，考察不同浓度水平的蔗糖（sucrose）,a-蔡乙酸（NAA）,6-BA对不定根诱导效果的影响。每瓶接种3个幼茎，每个处理10

6、瓶，25°C下暗培养，30d后以根数、根长、根粗为指标，观察、记录诱导效果。实验因素水平见表lo2.1.2综合加权评分正交试验考核指标采用综合加权评分法。按照指标的重要性，将平均根数（yl）、平均根长（y2）、平均根粗（y3）的权重系数分别设置为0.6,0.2,0.2o将3项指标中最好的定为100分,各项得分计算方法为各指标值yi与该项指数，综合得分为各项权衡后的得分之和，表1不定根诱导培养基筛选的正交试验因素水平Table1Thefactorsandlevelsoforthogonaltestofadventitiousrootinduction

7、ofPolygonummultiflorum即y=0.6(yli/ylmaxX100)+0.2(y2i/y加axX100)+0.2(y3i/y3maxX100)o2.2不定根悬浮培养基筛选采用L9(34)正交设计试验，考察不同浓度的蔗糖,NAA和生根粉(ABT-7)对不定根悬浮培养效果的影响。每瓶中液体培养基体积为40mL,分别接入8个约1cm长的根尖,每个处理10瓶，遮光摇床培养，并设立不遮光对照。试验因素水平见表2o表2不定根悬浮培养基筛选的正交试验因素水平Table2Thefactorsandlevelsoforthogonaltestofa

8、dventitiousrootsuspensioncultureofPolygonummultiflorum2.3不定根生