SNT1396-2004-弓形虫病间接血凝试验.pdf

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1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1396-2004弓形虫病间接血凝试验Indirecthemagglutinationtestfortoxoplasmosis2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和国、*V-*-.理曳〔』_“尤压，胜守a-tin户、4J、--‘从.-=.丝月勿c夕J飞氢拈庄幢了月宝立苛门.立tt丈汽乡、夕正习SN/T1396-2004月U吕本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国湖北出人境检验检疫局负

2、责起草。本标准主要起草人:陈建军、郭明星、付文鹏、赵晖等。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T1396-2004弓形虫病间接血凝试验范围本标准规定了弓形虫病的间接血凝(IHA)试验操作方法。本标准适用于动物弓形虫病的检疫、诊断及抗体水平的检测。2材料和试剂2.196(12X8)孔1100V型血凝板及玻璃盖板2.2可调式微量移液器及吸头2.3平板振荡器。2.4弓形虫IHA诊断液(抗原效价)1:1024)，标准阴性对照血清(效价<-1:4)，标准阳性对照血清(效价)1，1024)。2.5稀释液按附录

3、A所示要求配制，所用试剂均为分析纯。3采样无菌采动物静脉血液约1mL-2mL，静置自然析出血清或待血液凝固后以600g离心分离血清，56℃水浴灭活30min，预冷，用健康公绵羊红细胞(按血清/红细胞体积比约1:1混匀)室温吸附2h(或4℃冰箱过夜)，600g离心10min，取上清(要求无血球、无溶血、无杂菌污染)，置4℃冰箱备检。4操作步骤4.1取洁净的血凝板，于各孔中加入75IL稀释液。4.2取受检血清25fcL加人第一列孔中，用移液器反复吹吸混匀，取25pL加人第二列孔，混匀后取25pL加人第三列孔中，如

4、此4倍稀释至第6孔，混匀即1:4096弃去25pL(对于大量样品可只稀释至1，64见表1),表1弓形虫病间接血凝试验操作术式孔号1234567稀释液空血清稀释度0，)4166425610244096白对照稀释液/uL;:};:};:}::{;:{;:}47525受检血清/“L诊断液/uL2525252525一2525感作220C-370C静置2h^-3h结果举例(样)+十++十+++++4.3每次试验须同时作标准阴、阳性血清及稀释液空白对照，标准阳性血清对照应稀释至1:4096，标准阴性血清对照应

5、稀释至1，64，标准阴、阳性血清稀释方法同受检血清。4.4取弓形虫IHA诊断液(如为冻干制品需按使用说明洗涤稀释后使用)，于各检验孔中加入25夙，置振荡器上振荡约1min(或手持血凝板绕圈轻摇至各孔中血球分布均匀)，盖上玻璃盖板，22'C-370CSN/T1396-2004静置约2h-3h(当稀释液空白对照呈现“一”时)观察判定结果。5结果判定5.1判定方法a)100线的红细胞在孔底四周呈均匀、致密的膜样凝集，孔底中央无红细胞沉积，记“++++”。b)75%的红细胞在孔底四周呈膜样凝集，有少量未凝集的红细胞沉

6、积在孔底中央呈很小的圆点，记“+++”。c)50%的红细胞松散的凝集在孔底四周，其余50%未凝集的红细胞沉积在孔底中央呈较大的圆点，记“++”。d)25%的红细胞凝集在孔底四周，其余大部分未凝集的红细胞沉积在孔底中央呈很大的圆点，记“+”。e)所有红细胞均不凝集，全部沉积在孔底中央呈规则的最大的圆点，记“一”。5.2判定标准a)以呈现“++”的血清最大稀释度为该血清的抗体滴度。b)当阳性对照血清抗体滴度不低于1:1024，阴性对照血清各孔均为“一”(第一孔允许存在前滞现象“+”)，稀释液空白对照为“一”时，对

7、受检血清抗体滴度进行判定，否则试验不成立。c)受检血清抗体滴度)1，64时判为阳性(如表1所示血清抗体滴度为1:64，判为阳性)，(1，16判为阴性SN/T1396-2004附录A(规范性附录)稀释液的配制A.1pH7.2,0.15mol/L磷酸盐缓冲液(PBS):磷酸氢二钠(Na,HP0,·12H20)19.34g磷酸二氢钾(KH,PO,)2.86g抓化钠(NaCU4.25g叠氮化钠(NaN,)1.00g双蒸水(或去离子水)1000mL121'C,15min高压灭菌。A.2无菌取98mL上述PBS溶液，加人

8、2mL经560C30min灭活的健康兔血清，混匀，4℃下保藏备用。