供者凋亡细胞诱导恒河猴同种异体肾移植免疫耐受的初步研究

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1、博士学位论文供者凋亡细胞诱导恒河猴同种异体肾移植免疫耐受的初步研究博士研究生：范礼佩指导教师：钟世镇孙尔维赵明摘要背景在过去的几十年里，由于免疫抑制剂的发展，不仅使器官移植成为终末期肾、肝、心脏疾病可接受的治疗方式，而且显著减少了急性排斥的发生率，同时显著提高了器官移植的短期、长期生存率。然而，免疫抑制剂的应用带来了许多问题。首先，要终身连续对免疫系统进行非特异性免疫抑制。第二，当前使用的免疫抑制剂中，没有一种能完全预防急性排斥或者慢性排斥。第三，免疫抑制剂的应用带来了肿瘤和感染的风险。第四，免疫抑制荆的应用增加了移植病人高血压的风险以及由此导致的心血管

2、并发症。面对以上问题，新的免疫调节法增加了特异性，减少了这样的毒副作用．在最近，细胞治疗的研究取了显著的进步。特别是凋亡细胞的静脉输注能诱导实质器官的移植免疫耐受。在临床工作中，一些病人对移植物无限期地形成耐受，只须使用少量的免疫抑制剂，这况明在l艋床可以通过人工的方法诱导免疫耐受。我们的研究小组应用凋亡细胞诱导免疫耐受明显延长鼠心脏移植的存活时间，这一思路已经被国内外很多实验室所承认和重复。现已证明，在许多啮齿类小动物模型中，静脉输注凋亡细胞可以诱导供者特异性的移植免疫耐受，这给我们一个启示，在临床上是否也可以通过类似的方法诱导免疫耐受，从而有效延长移

3、植物存活，减少免疫抑制剂的使用呢?为了证明这个问题，我们首先选择非人类灵长类动物进行供体凋亡细胞诱导免疫耐受的研究。但是，在成功应用供体凋亡细胞诱导非人类灵长类动物移植免中丈摘要疫耐受之前，首先必须解决好以F几个问题：(1)测定恒河猴的类人血型；(2)要找到诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡的有效方法；(3)建立合适的与临床情况最相似、并且有利于免疫耐受研究的器官移植模型。许多文献报导传统的切除双肾的恒河猴肾移植模型术后因排斥反应、急性肾小管坏死等并症很容易导致恒河猴术后7一lO天死亡，不利于免疫耐受的研究，因此，要建立有利于免疫耐受研究的恒河猴肾移植模型。

4、本文对以上几个问题进行了研究，并初步研究了供者凋亡细胞对非人类灵长类动物同种异体’肾移植移植物存活以及急性排斥反应的影响。目的研究恒河猴类人血型的检测方法；建立恒河猴同种异体肾移植模型：研究诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡的方法；研究供者凋亡细胞对恒河猴同种异体肾移植免疫耐受的诱导。方法1、43只恒河猴，肌注氯胺酮麻醉后，分别抽取静脉血5ml，肝素抗凝。分别收集恒河猴唾液。应用常规单克隆抗体法、凝集抑制实验法(检测唾液)、抗A抗B凝集素检测法(反向定型法)共三种方法测定恒河猴的类人血型。2、建立恒河猴同种异体肾移植模型：4只恒河猴随机配成两对，每只恒河猴均

5、捐出左肾，保留右肾，同时接受另一只恒河猴的左肾移植。供肾切取：沿中线切开腹部，显露左肾。上血管央前给予肝素(100u／kg，iv)。切下肾脏后用4℃HcA保存液50ml灌注。受者手术：沿中线切开腹部，游离腹主动脉和下腔静脉远端，上血管央前静脉注射肝素(100u／kg，iv)。肾动脉、静脉分别于腹主动脉、下腔静脉远端行端侧吻合。血管吻合过程中应用显微外科器械、7／0无损伤血管缝合线。输尿管与膀胱吻合，并临时留置双猪尾支架管。术后给予阿司匹林lOOmg口服，共3天。术后采用亚临床剂量免疫抑制方案：甲基强的松龙十环磷酰胺+雷帕霉素。术中、术后一天、二天静脉注射

6、甲基强的松龙均为120mg；环lI博士学位论文磷酰胺20mg，术前4天开始，每两日一次：雷帕霉素0．4mg，手术日开始，每日一次。术后抗生素：硫酸庆大霉素(10000u／kg／d，IM)。3、在我们的研究中有一个重要的问题值得注意，即细胞凋亡后很容易发生继发性坏死，而坏死细胞对免疫的影响与凋亡细胞截然不同，因此在诱导细胞凋亡的同时应尽量减少坏死细胞。为此我们比较了高能X线法、C060Y射线法、紫外线(UVC)照射法三种方法，发现紫外线(UVC)照射法效果最佳，因此我们对紫外线照射法进行了详细的研究，在不同的照射时间(40，50，60分钟)、照射距离(15

7、，20，30厘米)、不同的小牛血清浓度(10％，15％，20％)、不同的液面高度(O．106，0．142，0．177厘米)等条件下的凋亡率，确定诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡的最佳条件。4、供者凋亡的单个核细胞预输注诱导恒河猴同种异体肾移植免疫耐受：6只恒河猴随机配对分为两组，即凋亡组和对照组。凋亡组接受对照组配对供者的凋亡细胞。制备的凋亡细胞用20mlPBS液稀释后输注给凋亡组配对的受者。对照组输注PBS液20ml作为空白对照处理。每只恒河猴均接受对方左侧供肾，行肾移植术，保留右侧肾脏。(1)大量凋亡的单个核细胞制备抽取供者恒河猴外周血50ml，应用淋

8、巴细胞分离液分离单个核细胞，应用UVC法照射单个核细胞，诱导单个核细胞凋亡条件：