钙网蛋白-n58在毕赤酵母中的表达及生物活性分析

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1、摘要新生血管的形成，是实体肿瘤组织得以浸润性生长和发生转移的必要条件，而成年动物／人在正常的生理状态下不存在新生血管形成，因此，血管生成抑制因子是低毒、无副作用、无抗药性的肿瘤治疗药物。钙网蛋白(CalretiClllin，CRT)是高等动物细胞中普遍存在的一种钙结合蛋白，具有分子伴侣、结合钙、信号转导、细胞吸附和基因表达调控等功能。V弱ostat矗是CI汀蛋白N．端结构域片段第1二180个氨基酸，是一种新型的血管生成抑制因子，具有抑制内皮细胞增殖、抑制血管生成的生物功能。有研究表明其主要活性部位存在于第120．180个氨基酸片段中。为了寻找高效和小分子量

2、的血管生成抑制因子，本研究采用PCR技术扩增a玎基因N端的第122．180位氨基酸的DNA片段，将CI灌N58基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K中，获得重组质粒pPIC9K．CImN58，用鼬n线性化重组质粒后，电激转化感受态酵母菌株GSll5，构建了能分泌表达CI浑N58蛋白的酵母工程菌GSll5(pPIc9K-CRT-N58)。经MD板和不同浓度G418筛选得到多拷贝重组菌株，重组菌株在甲醇诱导下分泌表达目的蛋白。SDS．PAGE分析结果显示，在甲醇诱导下，CR■N58蛋白成功地获得了分泌表达。经过初步纯化，将目的蛋白进行Q蝴血管生成抑制活性分析，

3、实验结果证明分泌表达的CImN58蛋白能抑制㈨血管的生成。本研究为寻找高效和分子量小的新的血管生成抑制因子和抗癌蛋白打下了良好基础。本实验成功地在毕赤酵母表达系统中实现了CahetiCulill．1、68的分泌表达，为caheticuHn．N58蛋白的进一步药用研究奠定了基础。关键词：钙网蛋白．N58，分泌表达，毕赤酵母，生物活性AbstractSolidtumorsaredependent0npreexistingVasculatureaIldneoVascul撕zatonfortheir孕。叭h锄dmet鹊asis．Becauseadultanimal

4、aIldpeopleintlleno衄alphysiolo百calstatedoesnotexistne0VaScularization，An百ogenesisillllibitorislowtoxicity，nosideeff．ectsandnod11JgreSistaIlttU珥0rtreatment．ChlreticuliniSaCalci岫bindingproteincxistedjnall觚imalCells．CalreticulinhasthefunCtionsofm01ecI】l舡chaperone，caldumbindiIlg，si印alt

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6、N．te皿iIlal锄iIloacids120—180．hl0rdert0se觚Chfore彤Ci％t柚dsmallmol咖lar卸giogenesisinllibitor'we0btainedCalreticIllin·N58geneby0verlap旺tensionPCR．nendonedCRT．N58genet0pl嬲midpPIC9Kt0conStructedrcc0忸bill锄texpressionpl舔midnamedpPIC9K-CR■N58．11hepPIC9K-CRT-N58waslinedby勋cI锄dtmsfo肋edintoPfc办妇

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