多环芳烃降解菌的降解特性与降解途径研究

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1、摘要多环芳烃(PAHs)是一类广泛分布于海洋环境中的典型的持久性有机污染物(POPs)，通过食物链的传递会对生态环境和人体健康造成极大危害。了解PAHs在环境中的来源、分布、归宿及去除问题，已成为当今环境科学研究的前沿课题。生物降解是环境(土壤，沉积物，水体)中PAHs去除的最主要途径。研究其遗传控制方式，探索代谢途径，是为了更好地将降解菌应用于有效而可控的生物修复之中。本论文将采集自厦门博坦油码头的海水样品，在持续性的高浓度、高分子量PAHs选择压力下进行富集驯化，获得高分子量PAHs的降解混合菌系，并以此讨论高分子量多环芳烃

2、(HMW．PAHs)降解菌的筛选策略；同时对筛选获得的2株能高效降解PAHs的细菌从生理生化角度、基因组学、蛋白质组学方面进行较为系统的研究，探讨其降解特性，解析相关功能基因及功能酶，并在这些基础上推测其代谢途径。获得的主要结果如下：1．用高浓度(1000m班)，混合n钮s(菲，芘，荧葸，苯并(a)芘)作为选择压力，从采自石油污染地区样品中驯化获得混合降解菌系，从中分离得到3株可培养单菌，变性梯度凝胶电泳(PCR—DGGE)跟踪分析驯化过程中的细菌群落结构变化及优势菌形成过程。采用高效液相色谱(HPLC)测定混合菌系BL和3株单

3、菌BLOl，BL02，BL03对高分子量、难降解的PAH_苯并(a)芘的降解能力，结合DGGE结果分析菌系中各单菌在降解过程中的作用。结果显示BL02，BL03不具有降解BaP的能力，BL0l14d后降解了20．98％，三菌混合培养物降解了22．61％；而混合菌系BL14天后降解了44．07％的BaP，这在同类报道中处于较高水平，显示了BL对BaP有较好的降解能力。该筛选策略有助于关注那些未可培养细菌在HMW．PAHs降解中的作用，因此采用高浓度、高分子量PAHs的选择压力筛选HMw．PAHs的降解菌是一种快速而行之有效的筛选策

4、略。2．对采自厦门海域的水样和沉积物样品，经过一定时间的PAHs富集培养之后，采用改良的平板升华法成功地筛选到两株菲高效降解菌，降解能力测定显示，它们都能以菲和荧葸作为唯一碳源生长，72h后均能完全降解起始浓度为lOO摘要mg／L的菲。16SrDNA鉴定结果显示这两株分别为鞘氨醇单胞菌印触妒mD，姗sp．B2．7和分支杆菌必阳D6口c胞，．f“所Sp．S8。3．通过降解菌对芳香烃化合物和PAHs降解过程中常见中间产物的利用情况，菌株B2．7能利用水杨酸，2一萘酚，邻苯二酚，初步推测它以水杨酸途径代谢菲，菌株S8不能降解萘，能利用

5、原儿茶酸，但是不能利用邻苯二甲酸，很可能是以邻苯二甲酸以外的途径代谢菲。降解菌降解荧葸的优化条件实验结果显示，非离子表面活性剂T、Ⅳeen-80和营养物葡萄糖能促进菌株B2．7和S8对荧蒽的降解。4．芳环羟基化双加氧酶和芳环断裂双加氧酶是PAHs降解过程中开环的两种关键酶，其中环羟基化双加氧酶(RHDs)控制苯环加氧，是微生物降解反应的限速步骤，邻苯二酚双加氧酶是催化苯环开裂的重要酶。我们通过引物设计的方法，从降解菌5叻f，挺汐肌D甩甜sp．B2—7中扩增得到全长的邻苯二酚．2，3·双加氧酶基因(C230)和环羟基化双加氧酶大亚

6、基p矗以)，从分子生物学角度证明了PAHs降解过程中的重要酶系邻苯二酚．2，3．双加氧酶(C230)和环羟化双加氧酶基因0【亚基(p^剃)在菌株B2．7中的存在。对p办删基因构建了重组表达载体，成功在表达宿主大肠杆菌EcD，fBL21(DE3)中进行表达，基因在宿主中以溶解蛋白形式存在。可以进一步推断菌株B2．7降解菲的基本途径是RHDs氧化PAHs形成二氢二醇PAHs化合物，再在C230的作用下经由水杨酸途径间位裂解(m吡cl铋vage)苯环，生成2．羟基粘康酸半醛(2一HMS)。5．采用1．DE(一向凝胶电泳)和2．DE(双

7、向凝胶电泳)结合LC．MS／MS(串联质谱)，研究菌株B2．7在菲诱导与无菲诱导(对照)状况下的蛋白质表达，对差异蛋白的生物质谱结果进行分析，得到多个代谢途径中的关键酶(加氧酶、脱氢酶、醛缩酶等)，结合菌株B2．7的降解特性与降解基因的研究结果，最终推导出菌株B2．7降解菲较为完整的代谢途径。关键词：多环芳烃，生物降解，苯并[a]芘，鞘氨醇单胞菌，双加氧酶，代谢途径2AbstractnlepresenceofpolycyclicaromatichydrocarbonS(PAHs)iIltIleenViror吼entisacons

8、iderablepublichealtllhazardbecauSeoftlleirintrinsicchemicalstabili吼K曲recalcit眦cet0dif!c．erenttypesofdegradationandM曲toxici锣t0liVing