法夫酵母摇瓶发酵条件优化和高产虾青素菌株诱变选育

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1、周元元：法夫酵母摇瓶发酵条件优化和高产虾青素菌株诱变选育!摘要虾青素是一种具有极强的生物抗氧化性的酮式类胡萝b素，在医药、食品、化妆品等方面有着极广阔的应用前景。法夫酵母(Phaffiarhodozyma)是生物合成虾青索的一个十分重要的生物来源。野生型法夫酵母菌株虾青素产量很低，发酵温度低，缺少实用价值。因此，本研究对法夫酵母的摇瓶发酵工艺及培养基组成进行了优化，同时进行了法夫酵母菌株传统选育法夫酵母高产菌株诱变筛选的条件，利用紫外和氯化锂复合诱变，得到一株高产耐高温的菌株UL-40。主要研究结果如下：1．观察了法夫酵母摇瓶发酵144dx时内的生长情况，测定法夫酵母的生物量、类胡萝b素产

2、量和培养基中的残糖，并且在光学显微镜和荧光显微镜下观察了细胞类胡萝b素的合成。结果表明，在发酵96d'时时类胡萝b素产量达到了最高值。而生物量则是在48小时就达到了最高值，培养基中的残糖在48小时几乎消耗殆尽。2．分别进行了接种时间、摇床转速、接种量和装液量对法夫酵母摇瓶发酵过程的影响的实验，确定了最佳的摇瓶发酵条件为：种瓶至摇瓶的接种时间为48hr，摇床转速为160rpm，接种量为10％，装液量为50mL。比较]'DMSO法、酸热法、碱法和自溶法等破壁方法和提取溶剂之间的差别，确定了酸热法和丙酮分别为合适的破壁方法和提取溶剂。3．利用SAS软件中的Plackett．Burman设计和响应

3、面分析法对摇瓶发酵时的温度、初始pH值以及发酵培养基的八种组分进行优化组合，从八个考察因素中选出发酵温度、初始pH值和Comsteepliquor浓度为重要因素，通过响应面分析法建立了模型：Y=3．6191-0．4633X1+0，1059X2—0．2454Xll一5．1102XIz_0．0630X2Z-0．2212Xll‘+O．0934XlX2．0．1286X1X11．0．2377XzXll，并从该模型中计算出在发酵温度为16．78"C、初始pHYb4．73和csL浓度为7．06mg／L时预测的最大响应值为3．9407mg／L，经摇瓶发酵实验证实此点的实测值为3．9261mg／L，证明模型

4、是有效的，并且存在极大值点。采用优化后的发酵条件及发酵培养基，法夫酵母菌株虾青素产量较原始发酵培养基提高了20．4％。4，通过实验确定了紫外线最适诱变剂量为30W、20cm下照射3min、亚硝基胍的最适诱变剂量15％g／mL以及筛选剂B．紫罗酮、硫酸铜、2一脱氧．D．葡萄糖、氯化锂的筛选剂量分别为0．4～0．69／L、0．6～0．8ejL、lg／L和39／L，而二苯胺则由于抑制色素合成的能力太强烈而不适宜用作筛选剂。对原始菌株1．14—22进行了紫外线一扬州大学硕士学位论文氯化锂复合诱变法夫酵母。经发酵培养，获得了一株遗传性状稳定、在25℃条件下虾青素高产的菌株UL-40。其类胡萝b素产量

5、为7．10mg／L。经高效液相色谱测定，色素组成中，虾青素为其主要成份。其虾青素产量为643．97I_tg／g，比出发菌株提高了249．87％。关键词：虾青素，法夫酵母，复合诱变，优化发酵条件，SAS软件，筛选剂，NTG，UV周元元：法夫酵母摇瓶发酵条件优化和高产虾青素菌株诱变选育!ABSTRACTAstaxanthinisakindofketocarotenoidwhichhasapowerfulbiologicalantioxidantactivityandhasbeenappliedinseveralfields，suchasinmedicine，foodandcosmeticeta

6、1．Phaffiarhodozymaisanimportantbiologicalresourceforastaxanthin，butithasseveraldisadvantagesinthesynthesisofastaxanthin，suchaslowproductionofastaxanthin，lowfermentationtemperatureandlesspracticalvalue．SoscreeningfurhighyieldstrainsofPhaffiarhodozymawi也normalfermentationcondtionsisveryimportantboth

7、fortheoreticalandpracticalapplicationInpresentstudy,thefermentationconditionsofPrhodozymahadbeenoptimizedinrockingflasksbyusingPlackeR-BurmandesignandResponseSurfaceAnalysisprovidedbySASsoftware，andtheadaptivedos