腺病毒介导bmp7和vegf165双基因转染兔骨髓间充质干细胞的体外相关实验的研究

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1、第二军医大学硕士学位论文AdAd5AdVAmpB．GalbpBSAcDNAcccDNACPECsClDM[EMDMSOD耵EDTAEtBrFBSmm己Karlkb缩略词表Adenovirus腺病毒Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdenoviralVector腺病毒载体AmpicillinB．GalactosidaseBasePair氨苄青霉素B．半乳糖苷酶碱基对BovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白ComplementaryDNA互补DNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNACytopathicEffec

2、t细胞病理效应CesiumChloride氯化铯Dulbecco’SModifiedEagleMediumDMEM培养基DimethylSulfoxideDithiothreitol二甲基亚砜二硫苏糖醇EthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EthidiumBromideFetalBovineSerum溴化乙锭胎牛血清小时InvertedTerminalRepeat反向末端重复Kanamycin．6．卡那霉素千碱基对腺病毒介导BklP一7和VE6F165双基因转染兔骨髓间充质千细胞的体外相关实验研究KDaLBMCSMillMOlm

3、RNAMWC0PAGEPBSPFUplRCARn：RSDSTCID50TCPTEwtKiloDalto璐LILria—Bertani(broth)MultipleCloningSiteMinute千道尔顿LB培养基多克隆位点分钟MultiplicityofInfection(Virus／CeU)感染复数MessengerRNA信使RNAMOlecularWeight摩尔分子量PolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PlaqueFormingUnitPostInfect

4、ion空斑形成单位感染后ReplicationCompetentAdenovims增殖性腺病毒RightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复十二烷基硫酸钠TissueCultureInfectiousDose5050％组织培养感染剂量TotalCellularProteinTris／EdTAWildType细胞总蛋白TE溶液野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3．indolyl-D-Galactopyranoside5．溴-4一氯一3一吲哚⋯13D半乳糖苷-7．独创性声明本人声明‘所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研

5、究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师

6、签名：签字日期：年月日签字日期：年月日腺病毒介导BMP-7和VE6F165双基因转染兔骨髓间充质干细胞的体外相关实验研究摘要咀的】研究BMP-7与VEGFl65联合基因修饰对兔骨髓间充质干细胞的影响，为构建双基因强化的组织工程骨提供理论和实验依据。防法】1、兔骨髓间充质干细胞的分离、培养；采用密度离一13,法与贴壁筛选法联合体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞，观察原代及传代细胞的牛长发育情况，并绘制牛长曲线。2、含目的基因重组腺病毒载体的构建；抽提MG63细胞的总mRNA，经RT-PCR获得BMP-7及VEGFl65蛋白编码CDS序列，继而将其插入带有腺病毒基因组

7、的、扩增后挑选插入方向正确的克隆，在脂质体介导下，用携带目的基因的质粒载体与腺病毒基因组末端蛋白DN√6门甲C共同转染293包装细胞，制备重组腺病毒，对重组腺病毒携带的目的核酸片段进行PCR扩增及酶切鉴定，将鉴定好的病毒克隆进一步扩增、纯化并测定滴度。3、携带目的基因的重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞；观察重组腺病毒能否成功的将目的基因转入骨髓间充质干细胞及转染后目的基因能否在重组干细胞中表达，并进行基因水平及蛋白水平的相关检测。【结果】1、提取的MG63总RNA完整，纯度高。逆转录合成扩增的目的核酸片段经克隆、测序后为目的基因(BMP-7及VEGFl65)，插入

8、质粒载体后获得高滴度的重