野生动物隐孢子虫的鉴定及隐孢子虫钙调蛋白基因的扩增 (1)

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1、1)独创性声明IIlllllllllllllIIIY1735180本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作并取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的相关材料。与我一同工作的人员对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：王心!他武I两：≯DlD年考只?口B关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规

2、定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。I保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：Iij∑砬第一导师签名：时阚：加№年s只fc)B时阃：沙fD年6只DEl摘要隐孢子虫病(Cryptosporidisis)是由隐孢子虫(Cryptosporidium)引起的一种以腹泻为主要临床表现，且呈世界性分布的人畜共患寄生虫病，该病严重危害人类健康

3、和畜牧业生产，也是人类艾滋病患者的主要致死因素之一。美国疾病预防控制中心已将其列为B类病原，我国2003年将该病列为重点防范的两种重要寄生虫病之一。近年来，隐孢子虫病研究在病原生物学、流行病学、诊断及综合防治等方面取得许多重要成果。但是由于隐孢子虫虫种间形态差异不明显，国内外又缺少隐孢子虫统一的分类标准，加之近年来分子生物学技术的应用，隐孢子虫的新基因型报道不断出现，从而引起隐孢子虫种类的分类产生较大的争议，这给预防和控制该病带来了极大困难。目前隐孢子虫的致病机理尚未完全清楚，同时也缺乏公认有特效

4、的治疗该病药物，因此，筛选有效的药物来防治该病是目前国内外研究的热点之一。本课题旨在通过对安徽省某动物园野生动物粪样中隐孢子虫的检测，初步筛选出隐孢子虫感染阳性野生动物，从阳性野生动物粪样中分离出隐孢子虫卵囊，采用形态学和分子生物学方法对所获卵囊进行鉴定，同时对野生动物源隐孢子虫钙调蛋白基因进行扩增，以期为人畜共患隐孢子虫病的防治提供理论依据，也为进一步研究隐孢子虫的代谢机理奠定基础。首先，采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对安徽省某动物园232份野生动物粪样进行检测，根据粪样中隐孢子虫卵囊的

5、形态、结构、大小、卵形指数等特征，对骆驼和猕猴源隐孢子虫种类进行鉴定，初步鉴定出骆驼源隐孢子虫为安氏隐孢子虫(Cryptosporidiumandersoni)，猕猴源隐孢子虫为人隐孢子虫(Chominis)。在本次所检测的232份野生动物粪样中，采用饱和蔗糖漂浮法检测时，草食类动物隐孢子虫感染率为4．88％(2／41)，灵长类动物隐孢子虫的感染率为13．64％(6／44)，肉、杂事类动物隐孢子虫的感染率为9．09％(4／44)，鸟类动物隐孢子虫感染率为6．80％(7／103)：采用改良抗酸染色法

6、检测时，草食类动物隐孢子虫的感染率为7．32％(3／41)，灵长类动物隐孢子虫感染率为2．27％(1／44)，肉、杂事类动物隐孢子虫的感染率为0(0／44)，鸟类动物隐孢子虫感染率为0．97％0／103)。而采用饱和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法的总感染率分别为8．19％(19／232)和2．16％(5／232)，经差异显著性检验(卡方检验)，两种检测方法差异极显著(P

7、孢子虫进行分子鉴定。首先，采用蔗糖密度梯度离心法对分离的隐孢子虫卵囊进行纯化，取纯化的卵囊，先用漩涡振荡器震荡20min，加2％DTT，再将卵囊置于一70℃冰箱反复冻融3次，提取其基因组DNA，备用。分别根据已报道隐孢子虫18SrRNA序列和HSP70基因序列设计并合成一对引物用于PCR扩增，对所扩增产物进行序列测定，所得序列经生物信息学方法，采用DNAStar软件对其序列进行分析，构建种系进化树。结果表明：采用PCR方法分别扩增出540bp和448bp大小的目的基因片段，序列分析可知，此次所分离

8、的骆驼源隐孢子虫为安氏隐孢子虫(Candersoni)。最后，采用RT-PCR方法扩增隐孢子虫钙调蛋白基因。首先，提取本次分离的骆驼源安氏隐孢子虫总RNA，并反转录成eDNA，然后，根据已报道的隐孢子虫钙调蛋白基因序列设计一对引物，扩增目的基因。结果表明，所扩增目的基因片段大小为297bp，与预期结果相一致。综上所述，本研究得出的野生动物源隐孢子虫鉴定结果为今后安徽省野生动物隐孢子虫病的防治提供了理论依据；对安氏隐孢子虫钙调蛋白基因的扩增，为今后隐孢子虫代谢机理等研究奠定基础。关键