家蚕中肠上皮细胞的增殖与分化——家蚕中肠干细胞的初步识别和鉴定

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1、摘要家蚕中肠上皮细胞的增殖与分化研究——家蚕中肠千细胞的初步识别和鉴定细胞生物学专业硕士研究生：李婷指导教师：崔红娟教授鲁成教授摘要干细胞是一类具有自我更新、无限增殖及多向分化潜能的细胞群体，目前针对昆虫干细胞的研究，是生物学领域的热点之一．肠道易受到各种损伤因子的侵袭，为使生命及新陈代谢过程有序进行，中肠组织内的细胞需要发生持续不断地更替，该过程主要依赖位于中肠上皮层内中肠干细胞(intestinmStemCell，ISC)的自我更新和增殖分化。解析中肠组织结构和鉴定中肠干细胞，是研究中肠干细胞维持及分化调节机制的基础，进而对揭示昆虫生长及变态发育和代谢调控

2、机理有重要意义，同时也为脊椎动物中肠干细胞的相关研究提供理论依据。家蚕属于完全变态昆虫，是鳞翅目类昆虫的典型代表，蚕的细胞遗传和连锁分析等研究较为深入，但对其中肠干细胞的研究目前还鲜有报道。家蚕的中肠上皮层组织在每个龄期蜕皮前都要发生大规模的更新，同时伴有组织重构，家蚕中肠干细胞直接参与该过程。本文观察和分析了家蚕中肠在不同龄期的组织结构的动态变化，并通过免疫荧光的方法检测家蚕中肠上皮细胞的增殖和有丝分裂，主要研究结果如下：l形态学分析系统观察家蚕中肠组织结构在其生长发育及变态过程中的动态变化家蚕各龄期的中肠组织经改良bouin液进行固定，石蜡包埋并连续切片后

3、，用常规H&E(hematoxylin—eos洫贼lling)病理染色法系统性地观察家蚕幼虫及变态发育阶段的中肠组织结构变化。统计分析各龄期内盛食期、眠前和眠期三个时间I西南大学硕+学位论文点的中肠横切面大小变化的结果表明，幼虫l、2、3、4龄期内的中肠横切面大小呈逐渐增加的趋势，并且眠前和眠期中肠的横切面显著高于盛食期(p<0．05)，同时发现位于基底膜处的小细胞在每次经历蜕皮之前会明显增多。5龄家蚕的中肠组织的结构变化与之前龄期有所不同，．起蚕至4天整个中肠组织横切面显著增大(p<0．001)，进入5龄末期的中肠发生明显皱缩，横切面显著减小(p

4、)。进入变态发育时期中肠的形态结构由幼虫时期长圆筒状逐渐萎缩变成略显扁平的椭圆形，幼虫的中肠组织开始出现大规模退化，并形成黄体(yellowbody'YB)排入肠腔，同时形成新的蛹．成虫中肠上皮层组织。利用DAPI染色技术统计分析l：2龄期各时间点内中肠细胞总数和三种类型细胞数目的变化情况，结果显示各种类型中肠细胞总数及各种类型的细胞数随着蚕体的生长发育呈显著增加的趋势(p

5、蜡包埋连续切片后，通过BrdU和PHH3两种抗体的免疫荧光双重标记，找到家蚕中肠上皮层中发生增殖的细胞，并对不同龄期所发生的增殖细胞数目进行统计分析。结果表明家蚕在眠前阶段的BrdU和PHH3标记阳性率都显著高于盛食期(p<0．05)，家蚕中肠内一些大细胞和小细胞能被BrdU不同程度的标记，而有丝分裂的常用检测物PHH3仅能标记位于上皮细胞层基底膜的小细胞。幼虫和蛹期中肠上皮细胞的BrdU阳性标记率呈显著性差异(p=o．027)，蛹期中肠的生命活动和上皮细胞更新速度都比幼虫时期缓慢得多。3BrdU滞留标记本实验采用经典的BrdU滞留标记实验(BrdUla_be

6、lretention)初步识别家蚕中肠内可能存在的干性细胞。通过对四龄家蚕三次间歇性注射BrdU(15ug)，利用其标记滞留细胞的方法，研究家蚕中肠上皮细胞层中可能存在的于性细胞数量、形态及分布特点。统计分析BrdU滞留标记阳性率的不同结果显示，在总体上从注射后24h至144h的阳性标记率呈显著的下降趋势(p=o．ooO)，经历一次蜕皮进入144h时阳性细胞数目仅占0．08％，此时期仅有靠近基底膜处的个别小细胞能被BrdU较长时间的标记。’关键词：家蚕中肠干细胞变态发育增殖与分化AbstractThePr01iferationandDifj陀rentiatio

7、noftheIntestineStemCellinSi11(Worm，BD聊勿Ⅸ聊o，ZCeUBiologymastercandidate：TingLiSuperVisor：Pro￡Hon西uanCuiandChengLuStemceUisahottopicofresearchhlbioIogical陀searc虬meyaredefinedbyVirtueoftlleir劬ionmspecialit)，iIlcludingpr01iferatio玛∞lf-豫newal，锄lddifrerentiation．Theintestinal协拟h弱arapidepit

8、lleli2LlCentumoVer’