南瓜蛋白对急性早幼粒细胞白血病nb4细胞株抑制增殖和诱导凋亡作用

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1、中文摘要南瓜蛋白对急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株抑制增殖和诱导凋亡的作用目的：研究南瓜蛋白(Cucurmosin，CUS)对人急性早幼粒细胞白血病(AcutePromyelocyticLeukemia,APL)NB4细胞株抑制增殖的作用以及CUS与常用化疗药联用对NB4细胞是否有增效作用；探讨CUS诱导NB4细胞凋亡的作用及其可能的相关机制，为CUS潜在的抗急性早幼粒细胞白血病的临床应用提供理论基础和实验依据。方法：1.采用MTT比色法，以阿糖胞苷（Cytarabine,Ara-c）作为阳性对照，测定CUS对体外培养的NB4细胞的增殖抑制作用。台盼蓝拒染法计数活细胞绘制生长曲线，检测CUS

2、对NB4细胞增殖能力的影响。2.MTT比色法观察CUS与亚砷酸(Arsenictrioxide，ATO)、全反式维甲酸（Alltransretinoicacid，ATRA）联用对NB4细胞增殖抑制的协同作用。3.Hoechst-PI染色荧光显微镜观察CUS作用NB4细胞后的形态学变化。电子显微镜观察CUS对NB4细胞超微结构的改变。4.DNA断裂琼脂糖凝胶电泳观察CUS作用NB4细胞后是否有典型的“阶梯状”凋亡片段。PI单染流式细胞术分析CUS对NB4细胞周期和凋亡峰的影响。AnnexinV/PI双染流式细胞术检测NB4细胞凋亡发生率的变化。5.Westernblot检测CUS作用NB4细胞

3、后凋亡相关蛋白Bax、bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9和下游效应分子PARP以及PML/RARa融合蛋白表达水平的变化。6.实时荧光定量PCR检测PML-RARa融合基因mRNA表达水平。结果：1.MTT比色法结果显示，不同剂量南瓜蛋白(0.0156、0.0312、0.0625、0.125、0.25、0.5、1umol/L)作用NB4细胞不同时间（24h、48h、72h）后增殖抑制率从13.3%提高到93.7%，其24、48、72h的IC50分别为1.235、0.089、30.055umol/L，呈时间和剂量依赖性。生长曲线的结果表明药物处理组的细胞生长

4、状态明显不如对照组，其生长缓慢的潜伏期延长，对数期曲线的斜率趋于平缓，随着药物浓度的增加，细胞数明显减少，细胞的倍增时间逐渐延长。2.同时MTT结果显示，CUS联合ATO、ATRA作用NB4细胞，与三种药物单用相比，联合作用组的抑制率均大于各药单用的抑制率，并且q>0.85。3.Hoechst/PI染色荧光显微镜下观测到CUS作用组细胞表现染色质固缩、凝集而被染成亮蓝色，核呈现分叶、破碎及边集等凋亡现象，凋亡比例依浓度依赖性增加，当CUS浓度达1umol/L时细胞均呈碎裂状。电子显微镜观察到，与对照组相比，实验组细胞体积变小、皱缩，细胞核明显减小且不规则，核内异染色质增多，核质比减小，出现典

5、型的凋亡改变，如核固缩，染色质浓集、核碎裂等；并有凋亡小体(Apoptosisbody)形成。4.DNA断裂琼脂糖凝胶电泳分析呈现典型的“阶梯状”DNA条带，呈约180-220bp整数倍递增分布。PI单染流式细胞仪DNA倍体分析呈现典型的亚G1(sub-G1)凋亡峰，不同浓度CUS（0、0.0156、0.0312、0.0625、0.25umol/L）作用72h后的凋亡率分别为0、23.1、31.9、44.2、59.8％，呈明显的浓度依赖性。AnnexinV/PI双染流式细胞术检测结果也同样显示细胞凋亡率呈量效关系，0、0.0156、0.0312、0.0625、0.25和1umol/L各组的凋

6、亡率分别为：1.7、2.4、2.8、4.9、7.4和17.0％。5.Westernblot结果显示：CUS作用NB4细胞72h后，bcl-2表达水平明显下调，而cleavedcaspase-3和cleavedcaspase-9、85kDPARP、Bax则表达显著上调，呈明显的时间和浓度依赖性。而pro-caspase-8表达未见明显变化，并且无cleavedcaspase-8表达。同时融合蛋白PML-RARa也以时间和浓度依赖的方式表达下调。6.实时荧光定量PCR检测结果显示，PML-RARa融合基因mRNA也呈浓度依赖性表达下调。结论：1.CUS对体外培养的NB4细胞具有明显的增殖抑制作用

7、，并呈时间-剂量依赖性。并且CUS与ATRA、ATO联用对NB4细胞体外增殖抑制有较好的增效作用。42.CUS能有效诱导人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞凋亡，并在一定浓度范围内呈时效和量效关系，线粒体细胞凋亡途径可能参与了CUS诱导的NB4细胞凋亡。3.CUS明显下调NB4细胞PML-RARa融合基因mRNA和蛋白的表达水平可能也是CUS抗白血病的作用机制之一。关键词：急性早幼粒细胞白血病；核糖体失活蛋白；南