sirt1基因对退变椎间盘调控作用及其机制研究

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1、重庆医科大学硕士研究生学位论文7代髓核细胞分别行形态学观察，SA．p．gal染色观察细胞衰老及甲苯胺蓝染色观察蛋白多糖表达。取同为第1代细胞分别进行单层培养和藻酸盐立体培养，观察其胞外基质表达和细胞增殖差异。结果：成功分离培养出原代髓核细胞，经大体形态观察，II型胶原和aggrecan细胞免疫荧光，HIF-10L细胞免疫组化及CD24流式细胞检测综合判定所培养的细胞为髓核细胞。形态学观测及SA．p—gal、甲苯胺蓝染色示，在体外连续单层培养条件下髓核细胞容易改变自身表型，发生去分化现象，且随着传代次数的增加趋

2、势愈加明显。藻酸盐培养条件下细胞增殖速率低于单层培养，但胞外基质collagenII和aggrecan表达显著提高。结论：酶序贯消化法可以成功培养出髓核细胞，单层培养过程中容易使髓核细胞失去固有表型，而藻酸微球培养环境有利于髓核细胞在体外培养条件下维持表型，维持胞外基质的表达，为进一步细胞学的检测打下基础。关键词：髓核细胞，酶序贯消化法，单层培养，藻酸盐培养第二部分白藜芦醇对退变髓核细胞合成胞外基质调控作用研究目的：研究SIRTl生物激动剂RES对人退变椎间盘髓核细胞合成ECM的影响。方法：取腰椎间盘突出症患

3、者术中摘除的髓核组织，对其进行分离、体外藻酸盐三维培养，采用不同浓度RES(50pmol／L和10pmol／L)1重庆医科大学硕士研究生学位论文和sirtinol(10“mol／L和1肛nol／L)分别刺激，PCR检测对SIRTl、II型胶原、aggrecan的mRNA表达。在10ng／mlIL-1B刺激下检测501amol／LRES与101amol／Lsirtinol对相关代谢酶MMP-2、13，ADAMTS一5，TIMP一1的mRNA表达影响。结果：白藜芦醇处理后，无论是RT-PCR还是qRT-PCR均显

4、示SIRTl、II型胶原、aggrecan的mRNA表达水平增高，qRT-PCR示RES亦明显抑制了IL一1p所诱导的MMP一2、13，ADAMTS-5的增高，TIMP-1的mRNA表达在与对照组的比较中显著升高，sirtinol组观测结果刚好相反。结论：RES可刺激退变髓核细胞ECM的合成，可以抑制IL-lD介导的对ECM的降解作用，这种调节作用与SIRTl的活性有关。关键词：髓核细胞，白藜芦醇，胞外基质，SIRTl第三部分SIRTl基因对早期退变髓核细胞胞外基质与细胞凋亡调控作用及其机制研究目的：研究SI

5、RTl对早期退变椎问盘髓核细胞ECM和细胞凋亡的调控机制。方法：取腰椎问盘突出症患者手术来源的髓核组织，运用磁共振，免疫组化，TUNEL染色，P53、P21蛋白测定以及甲苯胺蓝染色等方式初步探讨SIRTl与ECM和细胞凋亡之间的关系。对年轻组的髓核细胞行体外藻酸盐三维培养，运用SIRTl．siRNA和慢病毒介导的SIRTld重庆医科大学硕士研究生学位论文过表达载体转染髓核细胞，靶向调控SIRTl的沉默和过表达，检测其对ECM合成影响，加入10ng／mlIL一113刺激后，westernblot，DMMB法，流

6、式细胞仪检测胞内SIRTl受到靶向调控后对IL．1B诱导的胞外基质降解和细胞凋亡的影响。Westernblot检测慢病毒转染后对P65和乙酰化P65蛋白表达的影响，免疫共沉淀检测SIRTl与P65之间是否存在相互作用，细胞免疫荧光观察SIRTl对P65核内迁徙的影响。结果：老年组SIRTl的表达明显低于年轻组，而细胞凋亡率和合成ECM的能力亦明显低于年轻组。SIRTl表达被siRNA靶向沉默后，白藜芦醇对ECM的促进作用明显减弱。慢病毒转染成功后，SIRTl表达增高，酶的活性亦随之增高，但westernblo

7、t检测COL2A1和aggrecan的蛋白表达并没有明显差异，DMMB法测GAG表达与对照组相比也未见明显差异。但SIRTl过表达后对IL．1p介导的ECM降解以及细胞凋亡具有明显保护作用。SIRTl过表达后可以显著抑制IL．1B诱导的细胞凋亡，SIRTl．siRNA组的细胞凋亡率则明显上升。SIRTl过表达后能降低乙酰化P65蛋白的表达水平，阻止IL．1B介导的P65向核内迁徙，且免疫共沉淀示SIRTl与P65蛋白之间存在相互作用。结论：SIRTl在早期退变的髓核组织中存在着重要的调控作用，有望成为治疗椎间

8、盘退行性疾病的潜在靶点。关键词：SIRTl，髓核细胞，胞外基质，细胞凋亡，NF．rd3重庆医科大学硕士研究生学位论文THERoLEANDMECHANISMOFSIRTloNTHEDEGENERATIVElNTERVERTEBRALDISCABSTRACTIntervertebraldiscdegeneration(IVDD)isthepreconditionandpathologicalbasisf