感染性猪圆环病毒2型基因组dna的分子克隆

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1、维普资讯http://www.cqvip.com第l8卷4期中国病毒学18(4)：371—3752003年8月VIR0L0GICASINIGAAugust2003感染性猪圆环病毒2型基因组DNA的分子克隆芦银华，华修国2，崔立2，谈国蕾，许立华1,3，黄伟坚，陈德胜，陈溥言(1．南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室．江苏南京，210095；2．上海交通大学农学院，上海，200030；3．宁夏学农学院动物科学系，宁夏银川，750105)MolecularCloningoftheInfectiousGenomi

2、cDNAofPorcinecircovirusType2LUYin—hua，HUAXiu—guo，CUILi，TANGuo—lei，XULi—hua’，HUANGWei-jian，CHENDe．sheng．CHENPu—yanrJ．KeylaboratoryofAnimalDiseaseDiagnosticandImmunology,MinistryofAgriculture，NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095，China；2．Colle·．PofAgriculture

3、，ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200030，China；3．AnimalScienceDepartmentofAgriculturalCollege。NingxiaUniversity,Hnchuan750105，China；)Abstract：Thecompletegenomeoftype2Porcinecircovirus(pcv一2)wasamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR、andcloneddirectlyintomeEcoRIs

4、itesofplasmidpcDNA3，andrecominantplasmidcarryingthecompletegenomewasconstructed，designatedpcDNApcv2．TheentiregenomeofPCV一2waspurifiedandrecycledfrompcDNApcv2withthedigestionofEcoRIenzymeandthencirculargenomicDNAwasgeneratedbyself-ligatingwithT4DNAligaseinvitro．Th

5、enon—infectedPK一15cellsweretransfectedwiththePCV一2circulargenomeusingLipofectinReagent．Afterfourcontinuouspassages，PCV一2virusandspecificantigenswerevisualizedbyelectronmicroscopyandIFA，respectively．Thus，theclonedcircularPCV一2genomicDNAgeneratedinthisstudywasinfec

6、tiousfnvitro．Keywords：Porcinecircovirustype2；Completegenome；Transfection摘要：本研究通过PCR扩增出猪圆环病毒2型(PCV一2)的全基因组(1768bp)，克隆入pcDNA3载体的EcoRI酶切应点，获得含有PCV．2全基因组的重组质粒，命名为pcDNApcv2。将重组质粒大量扩增后，用EcoRI切出l768bp的PCV一2全基因组，在体外用T4DNA连接酶使其连接环化。用脂质体法将体外连接产物转染无PCV污染的PK一15细胞，经4次连续传代，用间接

7、免疫荧光实验(IFA)及电镜观察证实已获得复制能力的PCV一2病毒。由此可见，本试验构建的环化的PCV．2全基因组DNA具有感染性。关键词：猪圆环病毒2型；基因组；转染中国分类号：$852．65文献标识码：A文章编号：1003—5125(2003)04-037l一05根据基因组成及致病性不同，猪圆环病毒因组为独特的单链负股环状DNA结构，在宿主细(Porcinecircovirus。PCV)分两种血清型，即PCV1胞内的复制模式可能类似于大肠干菌入噬菌体的和PCV．2。PCV1无致病性，基因组全长1．759kb。滚环式复

8、制。软件分析表明，PCV基因组可能包PCV．2基因组为1．768kb，可致断奶仔猪多系统消括11个开放阅读框(ORF)。其中ORF1及ORF2耗综合症(PMwS)，主要影响6．8周龄断奶仔猪，的功能研究得较为清楚，ORF1编码与病毒复制相以呼吸困难、消瘦及免疫抑制为特征Il。PCV基关的Rep蛋白，ORF2编码病毒的