溶瘤腺病毒介导rna干扰抑制肝癌细胞生长实验的研究论文

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1、博士学位论文溶瘤腺病毒介导的RNA干扰抑制肝癌细胞生长的实验研究博士研究生：孙其酷指导教师：卢坤平教授马文丽教授摘要研究背景和目的原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤，药物是治疗原发性肝癌的重要手段。大量临床实践㈦21和实验研究【13。17】表明，复方苦参注射液对肝癌有较好的治疗效果【1，8，9，171。现代研究证实，复方苦参注射液具有抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化和促进肿瘤细胞凋亡等作用【13。16，18之31。复方苦参注射液虽然在肝癌的治疗过程中能发挥出较好的抗癌效果，但是与大多数中药一样，也存在有效成分不明确，质量控制标准复杂，不同厂家和不同批次的产品治疗效果不一致等等问题和缺点【2

2、4之引。随着现代生物科技的发展，人类对药物作用机制的研究已经深入到了分子水平，并逐步向系统化方向发展。综合基因表达谱芯片的研究结果129‘31】、免疫组化的研究结果以及对关键基因在转录水平和翻译水平的具体分析结果【13’21，32‘351，目前认为，复方苦参注射液主要从以下几个方面发挥其抗癌作用：1、对肿瘤细胞的直接杀伤作用：复方苦参注射液能够抑制肿瘤细胞内细胞周期蛋白El(CyclinE1)、生存素(Survivin)和B细胞淋巴瘤／白血病-2基因(B—celllymphoma／Leukemia-2，Bcl．21的表达，进而导致肿瘤细胞内Caspase．3的大量表达与激活，从而引起肿瘤

3、细胞大量凋亡，达到直接杀伤肿瘤细胞的目的【13,21,32】。2、对肿瘤细胞的间接杀伤作用：复方苦参注射液能够上调Fas等死亡受体在肿瘤细胞表面的表达，进而通过机体免疫系统，如特异性T细胞的细胞毒作用，摘要达到间接杀伤肿瘤细胞的目[拘[13,30,31】。3、抑制肿瘤的浸润和转移：复方苦参注射液能促进肿瘤细胞表达抑制转移因子nIn23【161，还能抑制肿瘤细胞表达粘附分子CD44v6，进而抑制肿瘤浸润和转移【19】。4、抑制肿瘤血管的生成：复方苦参注射液能抑制肿瘤细胞表达VEGF和CXCR4，这可能是复方苦参注射液抑制肿瘤血管生成的主要分子机$1J[33,34,36-3钔。5、复方苦参注

4、射液还具有缓解疼痛、提高患者生存质量和提高机体免疫力等方面的作用【39．541。有鉴于此，本研究设计构建了一个携带RNA干扰序列的溶瘤腺病毒，用RNA干扰的方法，靶向抑制肝癌细胞内CyclinE1、Survivin和Bcl．2的表达，参照复方苦参注射液直接杀伤肿瘤细胞的主要分子作用机制进行RNA干扰治疗，既克服了传统中药的许多缺点，又充分发挥了基因治疗的优势，从而使构建的携带RNA干扰序列的溶瘤腺病毒具备较好的抗癌能力，并有望发展成为一种新的用于肿瘤治疗的基因药物。复方苦参注射液可以通过抑制肿瘤细胞内CyclinE1、Survivin和Bcl．2的表达来发挥其直接杀伤作用。而这三个蛋白在

5、细胞的癌变和肿瘤细胞的增殖与凋亡过程中也扮演着重要的角色。其中CyclinE1和Survivin的过表达，是引起癌细胞周期调控异常和过度增殖的关键因素155拼】。而Bcl．2和Survivin则是导致癌细胞凋亡异常的核心因子【65击91。CyclinE1过表达会导致细胞G1期进程缩短，细胞增殖失控，进而促进细胞的恶性转化。抑制癌细胞的CyclinE1的表达，可以使其细胞周期停滞在G0／G1期，阻止其进入S期，从而起到抑制细胞增殖的作用【55’加1；Survivin则同时具备调节细胞周期和抑制细胞凋亡的双重作用，是联系细胞周期和细胞凋亡的关键因子，抑制癌细胞中Survivin的表达，可以抑

6、制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡【71。75】；Bcl．2在癌细胞抗凋亡过程中也发挥着重要作用，并且与Survivin有协同效应【65,76-79】，因此只有同时抑制Survivin和Bcl．2的表达，才能较好的抑制其抗凋亡作用，促使癌细胞走向凋亡。RNA干扰(RNAi，RNAinterference)作为一种抑制癌基因表达的手段，早已在肿瘤的治疗方面得到应用【80，811。常用的药物导入方法有两种，一种是体外合II博士学位论文成RNAi片段后，直接注射使用；另一种是构建RNAi表达载体，然后将载体导入细胞内，使其在细胞内表达相应的RNAi片段，达到治疗目的。前一种直接注射法虽然简单，但

7、存在免疫反应大，RNAi片段在体内大量降解，利用率低，治疗效果差等缺点，逐渐被淘汰【821。在第二种治疗方法中，载体的选择是关键，使用普通载体，如pGene．sil，存在转染效率低，抑制作用持续时间短，免疫反应大等缺点，无法在实际应用中取得良好效果[s3】。所以本研究采用溶瘤腺病毒(OncolyticAdenovirus)作为RNAi的载体，由于溶瘤腺病毒能够特异性的在肿瘤细胞中复制增殖，并能在肿瘤组织间自行扩散‘s4-ss]，因此