己烯雌酚酶联免疫快速检测试剂盒的研制

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1、己烯雌酚酶联免疫快速检测试剂盒的研制姓名：王蓓专业：食品科学与工程导师：胥传来摘要己烯雌酚(dielhylstillⅪ'slrol。DES)属于人工合成的雌激素，在人和动物体内会产生雌激素样效应。由于己烯雌酚对人体的致癌和致畸作用，世界各国均规定动物养殖中不得以任何途径和方式使用DES。本论文旨在研制快速检测己烯雌酚(DES)的酶联免疫(唧e-linkedimmunosorbentassay，ELlSA)试剂盒。首先用氯乙酸钠修饰DES分子中的一个酚羟基从而合成单羧甲醚己烯雌酚(diethylstil

2、bestrolmonocarboxymethoxyflurane，DES．MCME)。然后以混合酸酐法将DES．MCME与载体蛋白(bovineserumalbumin，BSA；ovalbumin，OVA)偶联形成完全抗原，并以紫外扫描分析完全抗原的偶联比率，再将得到的免疫原DES-BSA按免疫程序免疫新西兰白兔。结果发现己烯雌酚及其衍生物存在着顺反异构转化现象，极性有机溶剂的溶剂化作用促使顺反异构体的转化。高分辨质谱测得合成的DES-MCME分子量为325。人工免疫原及包被原的最适结合比为13和lO

3、。采用间接酶联免疫测定。产生的抗血清的稀释度可以达到102400。以此抗血清为基础，建立DES的间接酶联免疫方法。考察了反应时间、离子强度、洗液的浓度以及抗体稀释液的pH等影响因素。最终得到标准曲线的线性回归方程为Y钏．2978x+1．4756,R2=0．9986，其线性范围为0．1～25119·ml～，50％抑制率对应的浓度(IC50)为1．89ng-mFl，帅％抑制率对应的浓度(晟低检测限，LOD)为0．08ng．mL"1．利用五种结构类似的甾体化合物检测其特异性，均无明显的交叉反应。特异性好。利

4、用空白样品添加实验检测其精密度和准确度，DES以lng'g"’和5rig-g"1两个浓度分别添加到空白样品中测定回收率。结果表明：牛肉组织回收率为50～8(P,6。变异系数为3．7～8．艿％；猪肝的回收率为30～50％。变异系数为4．6～7．9％。将本试剂盒与荷兰EI瓜oDIAGNoSllCA公司的试剂盒进行比较，回收率、变异系数等结果基本一致，与LC／MS／MS方法比较，检测结果较接近。本论文研制的ELISA试剂盒的各项参数都达到了国外试剂盒的指标和要求，可用于实际检测。关键词：己烯雌酚；氯乙酸钠；

5、多克隆抗体；酶联免疫；优化Developmentofarapiddeterminationfordiethylstil—bestrolbyenzyme—linkedimmunosorbentassayName：WANGBeiSpecialty：FoodscienceandengineeringProfessor：XUChuaalaiAbstractDiethylsfilbestrol∞ES)，∞artificialestrogen,hasbeenbannedforitscarcinogenesisan

6、dteratogenesispropertiesinmostcountry．TllisstudyistodevelopDESresidualimmunoassayreagentkit．DiethylstilbestrolMonocathoxymethoxyfluranewassynthesizedbYmodifyingonephenolichydroxylgroupofDESmolecule．n七conjugationsofDES—MCMEwithbovineseRJmalbumin(BsA)ando

7、valbumin(ovA)assyntheticantigenswcrepreparedbythemixed∞idahhdfidemethodandtheconjugationmtesWel'eanalyzedbyultravioletscanning．NewZealandwhiterabbitswereimmunizedwithDES-BSA．11∞髑uItsdemonsWatedthattheisomerizationwaspresentincisandtransofDESanditsderiva

8、tus,whichwaseffectedobviouslybypolarsolvents．HigllttsolutionmassspccllxlmshowedthatthemolecularweightofDES-MCMEwas325．11地optimalconjugationratiosofimmunogenandcoatingantigenwere13andi0．Thediluterateofantisermnconldreach102400．thr