丁酸钠对胶质母细胞瘤u-251的放射增敏作用与其机制分析

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1、华中科技大学硕士学位论文独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本

2、学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密□，在_____年解密后适用本授权书。不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华中科技大学硕士学位论文三正文丁酸钠放射增敏胶质母细胞瘤U-251的作用及其机制研究恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的一大疾患，目前放射治疗是恶性肿瘤治疗的主要治疗手段之一，而肿瘤对放疗的耐受性是目前提高放射治疗疗效的主要障碍之一。不同肿瘤患者即使肿瘤类型、病理分级、部位等都相同，治疗的效果也

3、存在较大的差异，表明肿瘤细胞的内在放射敏感性（intrinsicradio-sensitivity）有显著不同。以增加肿瘤放射敏感性为目的的研究已进行了较长时间，但迄今在国际上仍未找到被公认的、低毒有效的增敏剂。有关肿瘤内在放射敏感性的分子和细胞生物学基础的研究表明，放射治疗主要是引起肿瘤细胞DNA损伤和与细胞凋亡有关的基因或蛋白的改变，从而启动肿瘤细胞的调亡过程。与细胞DNA双链断裂（double-strandbreaks,DSBs）修复能力有关的DNA-PK、Ku70、Ku80、ATM蛋白、P53蛋白，与细胞调亡、周期调控有关的P5

4、3、[1,2]p16、bcl-2和erbB-2等基因表达产物都证明与肿瘤的放射敏感性有关。以放射敏感性相关基因为靶点的基因治疗方案已成为放射增敏研究的重点。丁酸钠(Sodiumbutyrate，NaB)是食物纤维在人体肠道内酵解产生的一种短链饱和脂肪酸，是一种被广泛研究的组蛋白去乙酰基酶抑制剂（Histonedeacetylase[3]inhibitor，HDACi）。研究证实，NaB可以通过提高组蛋白乙酰化程度改变染色质[4,5]的结构，参与基因表达的调控，诱导肿瘤细胞周期阻滞、分化和调亡，然而对于NaB在肿瘤细胞放射增敏中的作用以及

5、其潜在的机制尚缺乏全面的研究。本实验通过观察组蛋白去乙酰化抑制剂丁酸钠（NaB）对胶质母细胞瘤U-251的放射增敏作用，探讨其对射线导致的肿瘤细胞核内DNA双链断裂修复过程的影响以及这一过程中可能涉及的分子机制。5华中科技大学硕士学位论文材料和方法一．材料（一）细胞系人胶质母细胞瘤U-251细胞系购于武汉大学中国典型培养物保藏中心（二）药品及主要试剂RPMI-1640培养液Gibco公司产品小牛血清Gibco公司产品丁酸钠Sigma公司产品PCR引物上海赛百盛基因技术有限公司TRIzolInvitrogen公司产品M-MLV逆转录酶Pr

6、omega公司二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒Pierce公司增强化学发光试剂（ECL）Pierce公司Ku70单克隆抗体武汉博士德γ-H2AX单克隆抗体Upstate公司异硫氰酸荧光素（FITC）标记二抗武汉凌飞科技有限公司（三）验仪器无菌操作台（型号SW-CJ-2Fb型，苏州泰安空气技术有限公司）二氧化碳培养箱（型号300/3000型，美国Harris公司）倒置显微镜（重庆光学仪器厂）荧光显微镜（日本OLYMPUS）激光共聚焦显微镜（日本OLYMPUS）分析天平（瑞士MettlerToledo公司）低温高速离心机（Eppend

7、orf公司）电泳及转膜装置（美国Bio-Rad公司）PCR仪（美国Bio-Rad公司）医用直线加速器（医科达公司）6华中科技大学硕士学位论文（四）溶液配制1．RPMI-1640培养液的配制：RPMI-1640培养基80%，小牛血清20%，加入适量青霉素及谷氨酰胺。2．PBS溶液：Nacl8.0g,Kcl0.20g,Na2HPO41.56g,KH2PO40.20g,溶于1000ml三蒸水中，调PH值于7.2-7.4，高压灭菌。3．胞消化液：胰酶0.25g,PBS100ml充分搅拌溶解，调PH值于7.3-7.4，0.22μm滤膜过滤除菌，分

8、装于-20℃冻存。4．细胞冻存液：RPMI1640培养基70m1、小牛血清20m1、DMSO10ml，各液体在无菌条件下配制，在-70℃冻存5．4%多聚甲醛：称取4g多聚甲醛溶于装有50ml的0.01mol