乳腺表达人ifnα--2b转基因小鼠模型的构建

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1、分类号S昼!三：三UDC密级博士学位论文乳腺表达人IFNot．2b转基因小鼠模型的构建论文答辩日期2Q12：墨：2§学位授予日期答辩委员会主席廑垄坚塾握论文评阅人游强以眵么5叼，广西大学学位论文原创性和使用授权声n,q／／I／／l／／H／I／／／I／／／／／ll／／／／ll／／／／I／／i／llli／(。／ll／丫z16。099本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一

2、同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均己在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。

3、刚不保密。(请在以上相应方框内打“√”')淼篓缎川勺麝型‘．罗篡黧砩孵掣邮?菇名移以加作者联系电话：一7≥7罗中夕占∥电子邮箱：厶

4、厶秒拈钞7卅I加乳腺表达人IFNot一2b转基因小鼠模型的构建摘要干扰素是人体在遭受病毒或其他病原体侵入时产生的一类细胞因子，除了能抵御病毒感染等功能外，还具有抑制细胞分裂、免疫调控和控制细胞凋亡等重要功能，是治疗病毒性疾病和癌症的最佳药物之一。根据干扰素不同的生物学特性、氨基酸组成和受体类型可分为多种亚型，其中IFNa．2b是目前临床上应用最为广泛的一个，常用于病毒性肝炎和一些癌症的治疗。IFNot．2b基因位于人类第9号染色体的9p2l区，编码165个氨基酸。成熟的IFNa一2b蛋白是一种含有5个a螺旋和2个二硫键的糖蛋白，分子量约为19．6kD。

5、乙型病毒性肝炎是全球高发性传染病，据统计全球慢性乙肝患者约为3．5亿人，约占总人口的6％，而我国乙肝患者约为1．3亿，占全国总人口的10％。作为抗病毒的有效药物，IFNa．2b的需求量非常大。但目前所有临床应用的重组IFNa．2b均为细菌生产，因缺乏一些必要正确的翻译后修饰和空间折叠，造成了它生物学活性低下，血液中半衰期短，甚至在病人体内产生抗体等缺点。所以利用哺乳动物乳腺生物反应器来大量制备具有完全修饰的高活性的重组人IFNa．2b是最佳选择。本研究拟通过制备重组人IFNa．2b转基因小鼠模型，为利用转基因水牛乳腺生物反应器生产重组人IFNot．2b

6、奠定技术和理论基础。分别克隆了娟珊牛p一酪蛋白基因的有信号肽(5244bp，3912bp)启动子和无信号肽(5165bp，3855bp)启动子，1166bppIoyA序列，荷斯坦奶牛p一酪蛋白基因有信号肽(5219bp，3887bp)启动子和无信号肽(5160bp，3830bp)启动子，l166bpployA序列。将克隆得到的8个启动子序列构建成8个启动子检测载／eqk(pEGFP—JS5．2BCNpsig，pEGFP．JS5．2BCNpnosig，pEGFP-JS3．8BCNpsig，pEGFP-JS3．8BCNpnosig，pEGFP—HST5．2

7、BCNpsig，pEGFP-HST5．2BCNpnosig，pEGFP—HST3．8BCNpsig和pEGFP-HST3．8BCNpnosig)，转染人乳腺癌细胞系Bcap．37细胞后，在激素的诱导下，可见EGFP基因的表达，表明所克隆的启动子是具有启动活性的。而后，与带6xHis标签的IFNa．2b基因和筛选基因Neo相连，构建得到8个乳腺特异性表达载体(pJS5．2BCNsig．IFN．JSpA．EGFP．Neo，pJS5．2BCNnosig．IFN-JSpA-EGFP-Neo，pJS3．8BCNsig—IFN-JSpA—EGFP-Neo，pJS3

8、．8BCNnosig—IFN—JSpA·EGFP-Neo，pttST5．2BCNsig—IFN—HSTpA．EGFP．Neo，pHST5．2BCNnosig-IFN-HSTpA—EGFP-Neo，pHST3．8BCNsig．IFN．HSTpA-EGFP—Neo和pHST3．8BCNnosig—IFN—HSTpA．EGFP—Neo)。然后，分别转染人乳腺癌上皮细胞系Bcap．37，筛选得到9个阳性细胞克隆。经荧光定量PCR、Westernblot和ELISA等检测发现，转染pJS5．2BCNsig-IFN—JSpA-EGFP—Neo载体的转基因细胞表达量

9、最高，并且所表达的重组IFNa．2b具有生物学活性。因此，此载体可用于制备转基因动物。将筛选得