新生隐球菌生物膜外分泌蛋白初步分析的研究

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1、第二军医大学硕士学位论文新生隐球菌生物膜外分泌蛋白初步分析的研究姓名：贾红玲申请学位级别：硕士专业：皮肤病与性病学指导教师：廖万清201206新生隐球菌生物膜外分泌蛋白初步分析的研究摘要生物膜是指由细胞外多聚基质以及被粘结的菌团组成。换言之，生物膜是一种附着于活组织或无活力组织的表面、由其自身产生的ECM包裹的由结构的菌细胞群体，是一种独特而复杂、相互依存的与表面有关的微生物群体，是细菌、真菌在生长过程中为适应生存环境而形成的一种与悬浮细胞相对应的生存方式。生物膜的显著特点是具有高度耐药性。目前估计约65％的人类感染与生物膜有关n1，而有学者认为大于80％的人类感染中有生物膜的形成扭3。

2、近30年来随着广谱抗生素和免疫抑制剂的大量使用，加上癌症及器官移植患者的增加，以及医学材料使用的增多，新生隐球菌感染呈上升之势。其中相当一部分与新生隐球菌形成生物膜密切相关。感染部位一旦形成生物膜或植入人体内的生物材料表面一旦形成了生物膜，由于其难以被大多数抗真菌药物等彻底杀灭，新生隐球菌生物膜引起的感性性疾病因而大都是慢性和难治性的。近年来有关新生隐球菌生物膜的基础研究和临床研究已引起国内外学者的高度重视。为了深入了解新生隐球菌生物膜的相关特征，首先应该对其形成的生物膜进行形态学观察。研究表明，生物膜的形成可以有几个明显的阶段；MTT比色法是目前定量研究真菌生物膜最常用的方法，能够间接

3、反映生物膜中活细胞的数量，从而分析生物膜的形成过程。iTRAQ技术在分离蛋白质混合样品，比较差异方面有不可替代的作用，它是目前比较新的一种分离成千上万个蛋白质组份的方法，与传统的双向电泳技术相比，在差异蛋白鉴定种类、分子量、灵敏性等方面都有着不可比拟的优势。本研究利用倒置相差显微镜及MTT比色法分析新生隐球菌生物膜形成的动态过程，为进一步了解新生隐球菌生物膜特性及其耐药机制提供理论依据；同时采用基础培养基96孔板培养的方法构建生物膜体外模型以及将菌悬液加入细胞培养瓶置于摇床上低速培养的方法构建新生隐球菌悬浮态模型，提取上清液中的外分泌蛋白，对外分泌蛋白进行初步纯化处理后运用iTRAQ技术

4、对其进行初步分析，寻找与生物膜形成有关的蛋白分子，为进一步了解新生隐球菌群体效应提供理论基础。综上所述，新生隐球菌可以在微孔板上形成典型的、成熟的生物膜结构，其形成过程有早期、中期、晚期3个阶段。新生隐球菌生物膜活性随培养时间延长第二军医大学硕士学位论文而增加，48h后代谢活性相对稳定。结论：新生隐球菌生物膜具有三维立体空间结构，其结构具有多样、不均质、开放的特点。同时运用iTl认O技术初步分析：可看到差异蛋白存在。关键词：新生隐球菌，生物膜，MTT减低法，iTRAQ新生隐球菌生物膜外分泌蛋白初步分析的研究AbstractBiofilmsarecomposedofanextracellu

5、larmatrixofpolymericsubstances．Inotherandinterdependent，commonlyattachedtobiologicalornon。biologicalsurfaces．Incomparisonwithplanktoniccells，itisalivingwaythatisadaptedtothesurvivalwords，biofilmsarestructuredmicrobialcommunitieswhichareencapsulatedbyECMgeneratedbythemselves．Thosemicrobialcommunit

6、iesareunique，complicatedenvironmentduringtheformationprocessofbacteriaandfunga．Thefeatureofbiofilmsistheirresistancetodrug．Atpresent，about65％humaninfectionsalerelatedtothebiofilmformation，whichisconsideredmorethan80％bysomereseachers．Intherecent30years，infectionofCryptococcusneoformansisontherisew

7、iththeheavyuseofbroad-spectrumantibioticsandimmunosuppressant，theincreasingofcancerpatientsandorgantransplanters，andthewidespreaduseofmedicinematerials，amongwhichmanyarecloselyrelatedtotheformationofCryptococcusneoform