乙型脑炎病毒双抗体夹心elisa抗原检测方法的建立与应用

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1、华中农业大学硕士学位论文乙型脑炎病毒双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立与应用姓名：梅力申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：曹胜波201206乙型脑炎病毒双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立与应用摘要乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(JEV)感染所引起的一种危害严重的虫媒性人畜共患病。该病毒主要经过扩增宿主猪和媒介昆虫蚊子进行传播。猪是其主要的扩增宿主和传染源。感染后可引起母猪流产、死胎、木乃伊胎及公猪发生睾丸炎，不仅给养猪业造成巨大经济损失，而且还严重威胁着人类健康。临床准确诊断是有效防控该病的重要途径。但由于传统的病毒分离鉴定方法操作

2、复杂、难度大、周期长，而RT-PCR等分子生物学方法虽然敏感，但操作技术要求高、需要特殊仪器设备、且易出现假阳性，因此，简便、准确、快速的抗原检测方法显得尤为迫切。本研究利用乙型脑炎病毒单克隆抗体和多克隆抗体，建立了可用于检测猪、人和蚊子等多种临床样品中乙型脑炎抗原的双抗体夹心ELISA方法，并制备了试剂盒，为乙型脑炎的临床快速诊断提供了有效工具。具体研究内容如下：1．JEv双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立本研究制备了兔源乙型脑炎病毒多克隆抗体。在此基础上，以已经获得的JEVE蛋白单克隆抗体作为一抗包被酶标板，兔源JEV多克隆抗体作为二

3、抗，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体与二抗反应，并通过催化底物显色以检测样品中是否含有JEV抗原。经过方阵滴定，确定了一抗的最佳包被浓度为5pg／mL，二抗和辣根标记抗体的最佳稀释度分别为1：10000和1：30000。敏感性试验表明，该方法的敏感性可达到104PFU／mL，并且该方法不与其它常见的猪流行病病毒发生交叉反应，对5份样品进行重复性检验的变异系数分别为7．60％、6．70％、6．70％、7．60％、4．40％，均小于10％，将包被的酶标板置于37"C连续5天，标准阴阳性对照的OD值均没有发生明显变化。以上结果说明，本研究所建立

4、的JEV双抗体夹心ELISA抗原检测方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好等优点：2．JEV双抗体夹心ELISA抗原检测方法的临床初步应用分别用RT-PCR方法和制备的双抗体夹心ELISA试剂盒对60份临床样品进行检测(包括16份人脑脊液样品、20份蚊子样品、24份猪脑样品)，并将二者检测结果进行对比。结果表明：与RT．PCR方法相比，JEV双抗体夹心ELISA检测方法的阳性符合率为70％，阴性符合率为100％，总符合率可达到90％。说明本研究建立的JEvELISA抗原检测方法与RT-PCR方法具有较高的符合率，可以作为JEV临华中农业大学20

5、12届硕士研究生学位论文床快速检测的有效工具。关键词：乙型脑炎；乙型脑炎病毒；单克隆抗体；多克隆抗体；ELISAII乙型脑炎病毒双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立与应用AbstractJapaneseencephalitis(JE)isaseriouszoonosescausedbytheJapaneseencephalitisvires(JEV)whichisamosquito—bornepathogenofthefamilyFlavivirus．Ingeneral，JEVismaintainedinatransmissioncycle

6、betweenamplifierswineandvectormosquitoes．Asallimportantpathogeninswine，itinducesterribleconsequencesinSOWSreproductionanddeathinpiglets．Atthesametime，italsothreatenspublichealth．SoaccurateclinicaldiagnosispavestheimportantwayinpreventingandcontrollingJEinfectioneffectively．

7、However,theapplicationofseveraldevelopedlaboratorymethodsforthedetectionofJEVantigens，suchasvirusisolation，RT．PCR，arelimitedbytheirrequirementsoflaboratoryoperations，skilledtechniciansandspecialfacilities．Therefore，itisimportantandurgenttoestablishamethodfordetectingJEVanti

8、gensimply,exactly,effectiyely．Adouble-antibodysandwichELISAmethodandanELISAkitford