bcl-2蛋白高表达pc12细胞系的建立及其对酒精诱导细胞凋亡效应的研究

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1、河南大学硕士学位论文BCL--2蛋白高表达PC12细胞系的建立及其对酒精诱导细胞凋亡效应的研究姓名：王利枝申请学位级别：硕士专业：护理学指导教师：刘彬；殷明伟201206摘要目的克隆小鼠BCL一2基因全长cDNA，构建真核表达载体pcDNA3．1(．)．bcl-2，并建立高表达BCL．2蛋白的PCI2细胞，为研究BCL．2蛋白在酒精诱导PCI2细胞凋亡中的作用提供依据。方法从小鼠脾脏中提取总RNA，采用RT-PCR方法克隆BCL．2的cDNA，DNA琼脂糖凝胶电泳检测产物并回收BCL．2基因。将全长BCL．2基因与pMD．19T载体连接，经蓝白斑筛选、克隆、转化、提取质粒

2、，经PCR及菌液DNA测序鉴定，检测BCL一2基因的准确性并检测是否成功重组质粒pMDl9一T-bcl-2。用HindlII和EcoRI两种限制性内切酶对质粒pcDNA3．1(．)和重组质粒pMDl9-T-bcl．2DNA进行酶切，切割产物经1％的DNA琼脂糖凝胶电泳分离后，用T4DNA连接酶将所需片段连接，转化、克隆、提取细菌质粒DNA，双酶切鉴定确定真核表达载体pcDNA3．1(．)．bcl-2是否构建成功。采用稳定转染的方法将真核表达载体转染至PCI2细胞，经G418筛选，分别从PCI2细胞、转染空载体pcDNA3．1(．)的PCI2细胞和转染了真核表达载体的PCI

3、2细胞提取细胞总RNA，采用RT-PCR的方法检测细胞BCL．2基因mRNA的表达，应用Western．blot的方法检测BCL．2蛋白的表达。MTT法测定不同浓度酒精(100mmoL／L、200mmoL／L、400mmoL／L)对三种PCI2细胞增殖的影响。结果从小鼠脾脏获得较纯的RNA，RT-PCR方法获得到BCL一2基因产物。BCL一2基因和pMD．19T载体连接后，经PCR和菌液测序证实，BCL一2基因正确且已和pMD．19T载体成功连接，得到重组质粒pMDl9．T-bcl-2。双酶切质粒pMDl9．T-bcl．2和peDNA3．1(一)DNA并经T4DNA连接酶

4、连接所需片段后，构建出真核表达载体pcDNA3．1(．)．bcl-2。从3种不同的PCI2细胞得到纯度较高的RNA，经RT-PCR和Western．blot分别检测BCL．2mRNA和蛋白的表达，结果显示成功建立了高表达BCL．2蛋白的PCI2细胞系。MTT结果表明，100mmol／L和200mmol／L酒精浓度时，BCL．2高表达的PCI2细胞组的生存率显著高于对照组(尸O．05)。BCL．2蛋白在酒精浓度为100～200mmol／L范围内，对酒精诱导PCI2细胞的损伤及凋亡

5、的有保护作用。结论1．利用pMD．19TVector成功构建出pcDNA3．1(·)一6c，-2真核表达载体，转染PCI2细胞后，表达高水平BCL．2mRNA和蛋白质。2．高表达BCL．2的PCI2细胞能在一定浓度范围内抵抗酒精对细胞凋亡的诱导作用。关键字：酒精，BCL．2，克隆，转染，PCI2细胞UABSTRACTobjective：WebuildthenuclearexpressesvectorofpcDNA3．1(一)-bcl-2withBCL一2cDNAcolonedfrommouse，thentransfectittOthePCI2cellandgetthePC

6、I2cellwithover-experssionBCL·2atlast,whichareusedforstudyingtheroleofBCL·2proteininalcohol—inducedapopotosisinthePC12cell．Methods：WeobtianthetotalRNAfrommousespleenandcolonethecDNAwhichreversetranscriptedfromthetotalRNA．obtaintheBCL一2DNAbyRT-PCRandthe1％DNAgelelectrophoresis．WelinktheBCL一2

7、tothepMD一19TVectorandextracttherestructuredDNAafterblue·whiteselecting，cloning，trans—forming．WedealwiththeDNAofpcDNA3．1(一)andpMD19-T-bcl-2whichhavebeentestedbyPCRandDNAsequencingusingtherestrictenzymesofH／ridIIIandEcoRIatthesametime，thenwelinktheneededfragmentswithT