b外源性dna残留量测定法

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1、附录ⅨB外源性DNA残留量测定法第一法DNA探针杂交法供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA的含量。试剂（1）DNA标记和检测试剂盒（2）DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。（3）2%蛋白酶K溶液称取蛋白酶K0.20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储藏于-20℃备用。（4）3%牛血清白蛋

2、白溶液称取牛血清白蛋白0.30g，溶于灭菌水10ml中。（5）1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0）用盐酸调pH值至8.0。（6）5.0mol/L氯化钠溶液（7）0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.0。（8）20%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液用盐酸调pH至7.2。（9）蛋白酶缓冲液（pH8.0）量取1mol/LTris溶液1.0ml（pH8.0），5mol/L氯化钠溶液2.0ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液2.5m

3、l，加灭菌水至10ml。（10）TE缓冲液（pH8.0）量取1mol/LTris溶液（pH8.0）10ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2ml，加灭菌水至1000ml。（11）1%鱼精DNA溶液精密称取鱼精DNA0.10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于-20℃备用。（12）DNA稀释液取1%鱼精DNA溶液50μl，加TE缓冲液至10ml。用于探针标记和阳性对照的DNA制备用于探针标记和阳性对照的DNA，由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交

4、瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考下述推荐方案进行，具体方法可参考《分子克隆实验指南》（［美］J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）或《精编分子生物学实验指南》（［美］F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998）。将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每1ml含107个细胞，如果为细菌，则将其浓度调整为每1ml含108个细胞细菌。取悬液1ml，离心，在沉淀中加裂解液400μl混匀，37℃作用12～24小时后，加入饱和酚溶液450μl，剧烈混合，以每分钟10000转离心10分钟，转移上层液体，以饱和酚溶液450

5、μl重复抽提一次；转移上层液体，加入三氯甲烷450μl，剧烈混匀，以每分钟10000转离心10分钟；转移上层液体，加入pH5.2的3mol/L醋酸钠溶液40μl，充分混合，再加入-20℃以下的无水乙醇1ml，充分混合，-20℃以下作用2小时，以每分钟15000转离心15分钟；用适量-20℃70％乙醇溶液洗涤沉淀1次，以每分钟15000转离心15分钟，弃上清液，保留沉淀，吹至干燥后，加适量灭菌TE缓冲液溶解，RNase酶切，酚/三氯甲烷抽提，分子筛纯化DNA，即得。用1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的DNA纯度：应无RNA和寡核

6、苷酸存在；A260/A280比值应在1.8～2.0之间（测定时将供试品稀释至A260为0.2～1.0）。用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声波处理，使其片断大小适合于DNA杂交和探针标记。阳性对照品的DNA浓度根据下式计算DNA浓度（ng/μl）=50×A260阳性对照品可分装于适宜的小管中，-20℃以下保存，长期使用。探针的标记按试剂盒使用说明书进行。测定法（1）蛋白酶K预处理按下表对供试品、阳性和阴性对照进行加样，混合后37℃保温4小时以上，以保证酶切反应完全。加样量2％蛋白酶K溶液蛋白酶缓冲液3％牛血清白蛋白溶液加水

7、至终体积供试品100μl1μl1μl200μlD1100μl1μl1μl适量200μlD2100μl1μl1μl适量200μlD3100μl1μl1μl适量200μl阴性100μl1μl1μl适量200μl注意事项：供试品的稀释根据成品最大使用剂量，用DNA稀释液将供试品（原液）稀释至每100μl含1人份剂量；如成品最大使用剂量较大，而供试品的蛋白含量较低，可用DNA稀释液将供试品稀释至每100μl含1/10人份剂量或每100μl含1/100人份剂量。D1、D2、D3为稀释的阳性DNA对照。用DNA稀释液稀释至每1ml中含DNA1000ng

8、。然后依次10倍稀释成10ng/100μl(D1)、1ng/100μl(D2)、100pg/100μl(D3)三个稀释度；如成品使用剂量较大，而且DNA限量要求（100pg/剂量