双光子dna荧光探针的设计、合成及其在生物荧光成像中的应用

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1、。山东大学硕士学位论文摘要，双光子过程是长波吸收短波发射，其吸收过程有着高度的三维空间选择性和高穿透性。基于此发展而来的双光子荧光显微镜为生命科学研究提供了重要工具。双光子吸收是在三维空间内的任一点的吸收，因此双光子显微成像可以不使用传统的小孔光阑就可以实现样本的三维成像。由于采用近红外的飞秒激光作为激发光源使得双光子荧光显微成像时不仅可以具有高的穿透深度而且可以有效的避免生物体系的紫外可见光损伤。但是双光子荧光探针研究的相对滞后限制了双光子荧光显微成像的发展，因此研究具有大的双光子活性吸收截面、优良的生物相容性的双光子荧光探针显得极为迫切。本论文主要是设计合成具有优良的双光子

2、性能、良好双亲性、优异的生物相容性的双光子DNA荧光探针，对其进行了一系列的光学表征并将其最终应用于生物细胞和组织中。本文的主要内容和结果如下：l、设计合成五个具有良好双亲性、优良的双光子性能的系列咔唑毗啶碘盐。主要使用Witting反应和Heck反应合成这些分子，其中对于Heck反应既有无水无氧高压条件下的反应，也有采用新的溶剂和催化剂的反应。所有的最终产物均采用了核磁共振氢谱，核磁共振碳谱，高分辨质谱，以及元素分析进行了表征，证明了得到的材料就是要合成的目标产物。在合成过程中利用溶剂挥发法生长得到了一种重要的有机中间体3,6．二甲酰基．9．乙基．咔唑的晶体，并用Bruker

3、P4X．ray型四圆衍射仪通过单晶X射线分析测得其晶体结构。2、详细讨论了不同极性溶剂对所合成的材料的紫外光谱、单光子荧光光谱，双光子荧光光谱以及量子产率和吸收截面的影响，并探讨了光物理性质与分子结构的关系。经过对比研究发现在咔唑N上引入乙基和分子两端链的增长有助于提高荧光量子产率和双光子吸收截面，在咔唑环上不同位置的取代也对探针分子的光物理性质有较大影响，2，7．位取代由于具有更好的共轭性从而使其单光子荧光量子产率更高，荧光寿命更长，在双光子荧光测试中也发现2,7．位的荧光强度比同样测试条件下3,6．位更强。3、研究了探针分子与ctDNA相互作用的紫外吸收光谱，单光子荧光光谱

4、和双光子荧光光谱，通过筛选重点研究了BMVC，BⅢEC，9E．BHVC的各种光物理山东大学硕士学位论文性质并预测了它们与DNA可能的结合方式。探讨不同激发光波长对探针分子与ctDNA结合后的双光子荧光光谱的影响，得到了三个探针分子的最佳双光子激发光波长，对它们在生物中的后续研究奠定了基础。经过体外实验研究得到BMVC、BMVEC和9E．BHVC可以用作光开关型荧光探针使用。4、把与ctDNA结合良好的BMVC、BMVEC和9E．BHVC用于固定的动物细胞、拟南芥植物活细胞和拟南芥植物活组织的染色，并通过DAPI的复染实验比较证明它们是可用的双光子DNA荧光探针。以9E．BHVC

5、为例与商品化探针DAPI对比研究了探测深度和荧光强度关系以及发射的荧光与入射光能量的关系。关键词：合成，晶体结构，DNA，双光子荧光探针，活细胞和活组织，核成像山东大学硕士学位论文ABSTRACTTherearecertainadvantagesintheprocessesoftwo-photonprossess：absorbinglongerwavelengthbutemittingshorterwavelength，highspatialselectivityandhighdepthofpenetration．Uponthesefeatures，itprovidesapow

6、erfultoolinthestudyofbiologythatW．Denketa1．inventiedthetwo-photonfluorescencemicroscopy(TPM)in1990．．Becausetwo-photonabsorptioncalltakeplaceinanypointofthree·dimensionalspace，TPMcanbeusedforbiologyspecimenthree—dimensionalimagingwithhighresolutionbutwithoutconfocalpinholes．Duetofemtosecondla

7、serwithIRoutputhavebeenusedaspumpingbeam，TPMpossesseshighdepthofpenetrationwithoutUV—visiblephotodamagetotissue．However,thelackoftwo-photonfluorescentprobehadlimitedthedevelopmentofTPMimaging．Inaword，itisveryimportanttostudytwo-photonfluorescentpro