内体酸化成熟障碍对lps活化巨噬细胞的调控作用及机制研究

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1、第三军医大学硕士学位论文内体酸化成熟障碍对LPS活化巨噬细胞的调控作用及机制研究姓名：杨洋申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：郑江201205第三军医大学硕士学位论文内体酸化成熟障碍对LPS活化巨噬细胞的调控作用及机制研究摘要脓毒症(sepsis)是由感染因素引起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)，是严重烧伤、创伤的常见并发症，进一步发展可导致多器官功能障碍综合症(multipleorgandysfuctionsyndrome，MODS

2、)和脓毒性休克(septicshock)，严重威胁患者生命。革兰阴性菌外膜中的主要成分内毒素(Lipop01ysaccharide，LPS)是脓毒症的主要病原体相关分子模式(pathogen—associatedmolecularpatterns，PAMPs)。LPS与其模式识别受体TLR4(Tolllikereceptor4)结合后可启动MyD88依赖和TRIF／TRAM依赖的两条信号转导通路，活化单核／巨噬细胞，激活炎症因子的转录与释放，导致炎症反应，过度的炎症反应可诱导脓毒症的发生。内化(internalizat

3、ion)是指细胞通过胞吞作用将胞外物质转运入胞内的过程。LPS—TLR4复合物内化入胞进入早期内体，然后通过晚期内体运送至溶酶体降解代谢，这一过程伴随着内体的酸化成熟。近期研究表明，LPS的内化与其对细胞的活化密切相关，本课题组前期研究结果也显示，内化抑制后，LPS刺激巨噬细胞活化的程度明显降低；内体酸化成熟障碍可抑制巨噬细胞的活化，对炎症反应具有抑制作用，但机制尚不明确。同时还观察到CQ预处理抑制内体酸化成熟后内化的LPS—TLR4共定位消失，这与以往的认知相悖，而这一现象与LPS内化和活化细胞的关系及机制不明确。因

4、此，本研究旨在探讨内体酸化成熟障碍对LPS活化巨噬细胞的调控作用及机制，为进一步深入研究LPS内化与细胞活化的关系及病理生理机制奠定基础。目的应用内体酸化成熟抑制剂氯喹(Chloroquine，CQ)抑制RAW264．7细胞内体酸化成熟，研究内体酸化成熟障碍对LPS活化巨噬细胞的调控作用及机制。方法1．内体酸化成熟障碍对LPS活化RAW264．7细胞的调控作用的研究(1)CQ(20I，tg／m1)预处理RAW264．7细胞lh，LPS(100ng／m1)束lJ激24h后收集细胞培养上清液，ELISA法检测TNF．a和I

5、L一6在蛋白水平的表达情况。(2)采用siRNA技术抑制RAW264．7细胞MyD88、TRAM的表达，LPS(100ng／m1)第三军医大学硕士学位论文刺激24h后收集细胞培养上清液，ELISA法检测TNF一0【和IL一6蛋白水平的表达情况。(3)小鼠炎症细胞因子抗体芯片技术检测CQ预处理及siRNA干扰MyD88、TRAM后细胞上清中炎症介质总体的分泌情况，并进行对比分析。2．内体酸化成熟障碍对LPS活化RAW264．7细胞的调控作用的机制研究(1)CQ预处理后LPS—TLR4复合物共定位消失现象的研究①利用CQ(

6、20I．tg／m1)及另一内体酸化成熟抑制剂一氯化铵(5001xg／m1)抑制RAW264．7细胞内体酸化成熟，FITC—LPS(200ng／m1)束lJ激lh，激光共聚焦显微镜观察FITC—LPS与Cy3一TLR4在胞内的共定位情况。②cQ(20pg／IIll)抑制RAW264．7细胞内体酸化成熟后，6FAM—CpGDNA(100ng／m1)刺激30min，激光共聚焦显微镜观察6FAM．CpGDNA与Cy5．TLR9在胞内的共定位情况。③动态观察内体酸化成熟障碍后LPS与TLR4在胞内的共定位情况TLR4：：YFP标

7、记质粒转染HEK293细胞，激光共聚焦显微镜观察。CQ预处理后于不同时相点观察LPS—TLR4的胞内分布情况。④内体酸化成熟障碍对内体循环相关调控分子表达的影响LPS(100ng／m1)束lJ激CQ(20／．tg／m1)预处理1h后的RAW264．7细胞，4h后，提取细胞总RNA，RealtimePCR法检测内体循环关键分子Rab7b、Rabl0、Rablla在核酸水平的表达情况。(2)内体酸化成熟障碍对炎症负调控分子表达的影响LVS(100ng／m1)*U激CQ预处理1h后的RAW264．7细胞，4h后，提取细胞总R

8、NA，RealtimePCR法检测负调控分子A20、Tollip及MyD88s在核酸水平的表达情况。结果1．内体酸化成熟障碍对LPS活化RAW264．7细胞的调控作用的研究(1)CQ预处理lh，LPS刺激后TNF—a和IL一6蛋白水平的表达被显著抑制。(2)siRNA技术抑制RAW264．7细胞MyD88、TRAM的表达后，TNF