骨髓间充质干细胞向成肌细胞诱导分化及大鼠间异体移植的研究

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1、河北医科大学硕士学位论文骨髓间充质干细胞向成肌细胞诱导分化及大鼠间异体移植的研究姓名：李松申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：邱建宏201203中文摘要骨髓间充质千细胞向成肌细胞诱导分化及大鼠间异体移植的研究。摘要目的：骨髓间充质干细胞(MSCs)具有向成肌细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞及神经细胞等多种成熟细胞分化的潜能，其来源丰富，分离、培养较为容易，在体外可多次扩增，自体移值不俘在组织配型及免疫排斥的问题。由于MSCs具有上述优点，使其引起了广泛的关注，尤其是组织修复方面，可将其应用于器官及组织的修复治疗中。本

2、实验通过研究骨髓问充质干细胞在不同条件下分离、纯化、传代、鉴定及诱导，得出培养骨髓间充质干细胞的最佳培养条件。并进一步用5一氮杂胞苷(5-Aza—CR)诱导其向成肌细胞分化，将诱导后的干细胞用BrdU标定，移值入SD大鼠膀胱肌层，观察其在膀胱肌层的存活及分布状况。方法：(1)MSCs的分离培养(2)MSCs的鉴定(3)MSCs的传代培养(4)不同种植密度对MSCs生长的影响(5)不同浓度胎牛血清对MSCs生长的影响(6)传代细胞的生长曲线(7)5-Aza．CR诱导MSCs分化为成肌细胞(8)MSCs受5-Aza．CR诱导后肌

3、分化相关蛋白的表达(9)BrdU转染及鉴定(10)骨髓间充质干细胞异体移植结果：(1)MSCs的分离培养脱颈处死6周龄SD大鼠1只，75％酒精浸泡5rain灭菌，取出大鼠双侧胫骨及股骨，剪去长骨两端，暴露骨髓腔，5ml注射器反复冲洗得到单细胞：悬液，移入细胞培养瓶中。根据MSCs与杂质细胞的贴壁时间差纯化干细胞，镜下可见细胞开始贴壁变形，原代干细胞呈圆形、三角形、多角形，杂质细胞形态呈圆形或不贴壁。培养48h后，显微镜下观察可见贴壁细胞数量明显增多，部分呈集落样生长。培养4～6d后，贴壁细胞分裂增殖明显，可见较多的分裂相，随

4、着细胞数目增多，二维生长的干细胞群内空间趋于狭窄，故出现漩涡样，成纤维样细胞集落。(2)MSCs的鉴定对干细胞的鉴定仍然是一个难题，目前尚无统～的、权威的标准。目前的现状是，大多数人采用联合应用多种抗体分离鉴定MSCs，一般采用排除法或推逆法对其进行鉴定。目前最常用的间充质干细胞阳性标记物有：SH．2、SH．3、SH．4、CD29、CD44、中文摘要CD54、CD73、CDl05、CDl667孛；阴仨}标’}己物有：CDl4、CD34、CD45、CD34、CD3l、V岍等，本实验选择CD29，CD44作为阳性标记物，CD34

5、，CD45作为阴性标记物，以免疫组化法检测细胞特异性抗原。(3)MSCs传代培养10．14天，细胞密度逐步增加，融合成片。传代接种后的细胞分布均匀，以梭状为主。传l、2代的MSCs形态均一，呈长梭形，杂质细胞随传代、换液逐渐减少。培养至传P8(传八代)细胞，干细胞仍然存活，但细胞生长缓慢，形态开始变化，折光性较差，歼始脱壁凋亡。(4)不同种植密度对MSCs生长的影响在106／ml密度接种时MTT比色法检测OD490值最大，活细胞数量多，细胞活性较好，较利于MSCs的生长。(5)不同浓度胎牛血清对MSCs生长的影响在10％一-

6、15％的胎牛血清浓度时MTT比色法检测OD490最高，证明10％'---15％血清浓度最适膏：MSCs生长。(6)传代细胞的生长曲线细胞生长曲线呈S形，增殖包括滞留期、对数生长期、平台期三个时期，PI(传-i-℃)细胞增殖较快，其速度明显快于其他时期。(7)5-Aza．CR诱导MSCs最适浓度测定及诱导效果不同浓度5-Aza．CR诱导MSCs，在lOumol／L的浓度时MTT比色法检测OD490最高，证明10umol／L5-Aza—CR浓度最适宜MSCs诱导。以lOumol／L5-Aza．CR诱导传MSCs，4d后未发现干细

7、胞胞体明显变化，10d见小部分细胞胞体增大、变长，13d可见部分细胞相互接触，至15d一17d可见有类肌管样结构出现。(8)MSCs受5．Aza．CR诱导后肌分化相关蛋白的表达诱导后的细胞4d检测，未发现细胞表达肌细胞特异抗原，诱导后的细胞12d后，细胞表达desmin(结蛋白)明显呈阳性，5-Aza—CR诱导后14d表达myosin(肌动蛋白重链)程度明显呈阳性。(9)BrdU转染及餐定在传3代干细胞中加入含BrdU40lag／ml标记培养基，转染48h，观察可见细胞生长良好，悬浮死亡细胞较少，进一步铺片以免疫组化法检测转

8、染情况，可见部分细胞核呈棕黄色，说明转染成功。(10)骨髓间充质干细胞异体移植将诱导后的于细胞用BrdU标定，手术直视下移植入大鼠膀胱内，4周后取出大鼠膀胱，以免疫组化法检测发现，移植细胞在活体大鼠膀胱内可继续生存且分布均匀。结论：(1)骨髓提取培养后得到的不是单一种类细胞，骨髓间充质干细