四川部分地区藏羊源、兔源和牛源隐孢子虫种系发育研究

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1、万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特J)J；hD以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川I农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。一虢己弓I弭0o似年／月／P-B关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借

2、阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。。彳≥论文不保密。(请在以上口内划“√”)厂]—-1研究生签名：煽㈦导师签名移哆口本论文保密，在一年解密后适用本授权。a。，弘年6月，，支f3三矽／够“月／>咽万方数据IlIHOIIMHIIIJ0120833本论文由以下基金资助成都大熊猫繁育研究基金会项目(OPF申2012—01)；教育部“长江学者和创新团队发展规划"创新团队项目(1RT0848)；2013年四川省学术带头人培养项目(83120220)万方数据

3、四川农业大学2014届硕士学位论文摘要隐孢子虫是一种具有传染性的专性胞内原虫寄生虫。隐孢子虫病是全世界最常见的食物和水源性疾病之一，常导致动物和人发生腹泻。在具有免疫能力的个体内，隐孢子虫通常引起自身限制性腹泻，2．3天可自行消退。然而，隐孢子虫病却可能威胁动物和免疫抑制人群的生命。2003年，隐孢子虫病己经被我国列为重点防范的两种寄生虫病之一。一般情况下，粪便检查中出现4-61sin大小的球状卵囊即可确诊隐孢子虫感染。但是隐孢子虫种类的鉴定还必须结合形态学，分子生物学和宿主特异性等数据共同进行分析。为了解四川部分地区藏羊、兔和牛隐孢子虫感染情

4、况，采用饱和蔗糖溶液漂浮法对1274份粪便样品进行检测，包括道孚县某养殖厂34份藏羊粪样，雅安2个兔场共584份兔粪样以及达州、宜宾、邛崃和红原县6个牛场共656份牛粪样。结果表明，藏羊隐孢子虫感染率为2．94％(1／34)：兔隐孢子虫感染率为3．6％(21／584)，1月龄以下兔感染率最高；牛隐孢子虫感染率为2．13％(14／656)，2．6月龄牛感染率最高。为确定藏羊隐孢子虫感染种类，通过巢式PCR扩增阳性分离株的18SrRNA、HSP70和CpAl35位点基因，并采用限制性内切酶却I和VspI对18SrRNA产物进行酶切分析。同时构建系统

5、进化树，分析藏羊感染隐孢子虫类别。结果显示此藏羊感染隐孢子虫18SrRNA与Cxiaoi(GU553016)样1似率为99．9％；HSP70与Cxiaoi(FJ896041)相似率为98．7％；CpAl35与Cubiquitum(HM358023)相似率为99．3％。18SrRNA产物经SspI酶切后获得3条条带493bp、262bD和103bp，经VspI酶切后获得3条条带508bp、t81bp和104bp，与C．boris酶切条带相似。基于18SrRNA和HSPT0的系统发育分析显示，该分离株与C工iaoi亲缘性最近。为确定兔隐孢子虫感染种

6、类，通过巢式PCR扩增21份阳性分离株的18SrRNA、HSP70、CpAl35、COWP和GP60位点基因，同时构建系统进化树。结果显示所有21株隐孢子虫均为C．cuniculus。18SrRNA与c．cunic“h4s(GU097631)相似率达100％；HSP70与c．cuniculu．，(GU097646)相似率达100％，万方数据四川农业大学2014届硕士学位论文CpAl35与Ccuniculus(KCl57564．)相似率达100％，COWP与C．cuniculus(GU097635)相似率100％，GP60显示其亚型为VaA31。

7、为确定牛隐孢子虫感染种类，通过巢式PCR扩增14份阳性分离株的18SrRNA位点基因，并采用限制性内切酶SspI和VspI对18SrRNA产物进行酶切分析，同时构建系统进化树。结果显示，DZl、DZ2与Cryanae(HQl79574)相似率达100％；YBl与Candersoni(AB777194)相似率达100％，；QLl、QL3一QL5、QL8．QLll与c．andersoni(KF271480)相似率达100％；QL2、QL6、QL7与Cboris(JX515546)相似率100％。DZl、DZ2、QL2、QL6和QL7ss；I酶切条带

8、约为430bp、270bp、100bp，VspI酶切条带约为620bp、115bp、105bp，与C6Dv如和Cryanae酶切条带一致；YBl、QL