儿童血清25羟基维生素d水平及其受体基因多态性与哮喘的相关性研究

《儿童血清25羟基维生素d水平及其受体基因多态性与哮喘的相关性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号UDC密级编号角方霜纠戈膨硕士学位论文儿童血清25羟基维生素D水平及其受体基因多态性与哮喘的相关性研究Thestudyontherelationshipbetweenlevelsofserum25-hydroxyvitaminDandit’Sreceptorgenepolymorphismsandasthmainchildren陈晓锐导师姓名专业名称培养类型论文提交日期赵宏霞教授儿科学专业型2014年3月14日 南方医科大学2011级硕士学位论文儿童血清25羟基维生素D水平及其受体基因多态性与哮喘的相关性研究TheStudyontherelationshipbetweenlevelSofserum25一hydroxyvitaminDandit’Sreceptorgenepolymorphismsandastlmainchildren课题来源：深圳市课题学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院陈晓锐赵宏霞教授儿科学专业型硕士南方医科大学附属深圳妇幼保健院2014年3月14日广州II 硕士学位论文儿童血清25羟基维生素D水平及其受体基因多态性与哮喘的相关性研究硕士研究生：陈晓锐指导教师：赵宏霞摘要一．研究背景支气管哮喘是一种常见的呼吸道疾病，也是影响儿童健康最常见的慢性气道疾病之一，在全球范围内其发病率逐年上升，给患者家庭及社会带来了沉重的健康及经济负担，因此对支气管哮喘进行深入的研究具有深远的社会意义。支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T细胞、气道上皮细胞等多种炎性细胞共同参与，它的重要特征是持续性气道炎症，慢性气道高反应性和可逆性气流阻塞。引起患儿反复发作的喘息、气促、胸闷或咳嗽等，并多在夜间和(或)清晨发作或加剧。严重者可出现哮喘持续状态危及生命，影响了患儿的身心健康。哮喘的发病机制复杂，与免疫和遗传学背景等密切相关。近年来，国内外研究发现，维生素D(VitD)在哮喘的病因学中可能发挥着重要的作用。既往研究认为维生素D具有调节骨代谢和钙平衡的作用，而今越来越多的流行病学、遗传学和动物模型实验研究表明，其作为一种第二类固醇激素，还具有强大的免疫调节作用，与固有和适应性免疫应答均有密切关系。研究发现它可抑制各种Thl免疫反应介导的自身免疫性疾病的演进，如炎症性肠病(inflammatoryboweldisease，IBD)、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化(MultipleSclerosis，MS)、I型糖尿病(Type1DiabetesMellitus，T1DM)等，并可能参与了哮喘的发病。相关研究表明减少阳光暴露与哮喘发病有关，而维生素D被认为是联系阳光暴露与哮喘发病之间的中介物。 中文摘要维生素D缺乏与不足在全世界均有较高的发病率，甚至发生在阳光暴露很充足地区的人群中，儿童是其高危群体，而25一(OH)一VD是人血清中含量最多且最稳定的VitD3代谢物，也是判断体内在皮肤合成的或经饮食摄入的VitD3含量的最佳指标。因此，在哮喘儿童中检测其维生素D水平具有重要的临床意义。支气管哮喘属IgE介导的I型慢性变态反应性疾病，CD4+T淋巴细胞被认为在支气管哮喘的发病过程中起重要的调控作用，根据其分泌的细胞因子不同，分为Thl、Th2两个亚群，目前认为Thl／Th2细胞失衡是哮喘发病的重要基础。越来越多的研究证实维生素D通过多种免疫细胞如肥大细胞、树突状细胞(DCS)、调节性T细胞(Tregs)等及其分泌的细胞因子的相互作用在哮喘的发病机制中发挥着重要的免疫调节作用。有资料表明，维生素D缺乏可能导致Tregs功能下降，Thl和Th2之间的平衡被打破。Camargo等研究证实l，25-(OH)-VD抑制Thl细胞的分化，实验证明它在体外对于初始T细胞极化过程中(Th分化的初期更明显)IL一4的产生有下调作用，对于Th2细胞分化及气道嗜酸性粒细胞也有着很好的抑制作用。Topilski等建立了鸡卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)鼠哮喘模型，实验发现在哮喘诱发的最初阶段或Th2细胞分化完成阶段给予1，25-(OH)_vD显著地抑制了气道炎症反应和降低了支气管肺泡灌洗液中IL一4的水平。1，25-(OH)-VD可抑制效应性T细胞迁移，使其不能顺利到达其发挥效应的炎症部位。因而1，25-(OH)-VD对哮喘的影响机制可能包括下调IL一4和阻断效应T细胞迁移这两个方面。Pichler等发现在人类脐血单个核细胞中维生素D不仅抑制由IL一12介导的IFN—y产生，同时也抑制了工L一4及由IL一4介导的IL-13的产生；但也有相反的证据，Aheu等对相当于人类预防佝偻病剂量的1，25一(OH)-VD与哮喘发病间的关系进行了动物实验研究发现维生素D可以促进抗原特异性T淋巴细胞的增殖，上调IL-4及IL-13等Th2型细胞因子的分泌，增加IgE的分泌。维生素D对Th2分化的作用及其具体机制如何，有待于更多的实验研究证实。血清维生素D水平与日照时间、地理位置、饮食等因素有关，如紫外线强度及量适中促进维生素D吸收，海拔高的地方较海拔低的地方更易发生维生素DII 硕士学位论文不足与缺乏等。除此以外，血清维生素D水平还与遗传因素密切相关。目前已发现了大量的与维生素D代谢及作用途径中相关的基因多态性，如细胞色素P4502R1(CYP2R1)基因、维生素O(VDR)基因、GC一球蛋白(GC)基因、细胞色素P45024A1(CYP24A1)基因等的突变可导致维生素D水平的异常。目前研究最多的是CYP2R1基因、VDR基因。自1994年Morrison首次报道VDR基因多态性与骨密度的关系以来，对VDR基因多态性与糖尿病、结核、骨代谢、生长发育相关性的研究，一直是学者们关注的热点。VDR是维生素D生物活性形式1，25-(OH)-VD发生作用的主要受体，VDR基因于1988年被克隆出来，其定位于12q12-q14，长度为60-70kb，包括9个编码的外显子，共编码427个氨基酸，有多项研究显示VDR基因是观察哮喘基因非常好的候选者，其多态性与儿童和成人哮喘的发生具有相关性。VDR基因有5个常见的单核苷酸多态性位点(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)分别是FokI(rs2228570)、Bsml(rsl544410)、Tru91(rs757343)、ApaI(rs7975232)和TaqI(rs731236)，分别位于第2外显子、第8内含子和第9外显子，及在3’端下游区域的p01y—A多态性。rs2228570(FokI)位于第2外显子，在VDR基因的起始密码子上为T—C变异形成的。导致编码氨基酸密码子427ATG—ACG突变，使得翻译起始位点位于3个密码子以后，即翻译的蛋白质少3个氨基酸，为424个氨基酸，转录活性大大增强；rs7975232(ApaI)位于VDR基因第8个内含子，由于G—T突变，导致胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤；rsl544410(BsmI)则由于G—A突变，其多态性虽不影响VDR的氨基酸序列，但蛋白质的合成受mRNA3’末端非翻译区的调控，rsl544410和rs7975232的多态位点正位于该区域，其碱基的改变影响了mRNA的稳定性，从而影响了VDR的表达；rs731236(TaqI)多态位点则是位于VDR的第9外显子，327ATT---ATC突变，其多态性是由无义突变引起，虽不会使VDR的氨基酸序列改变，但可能会导致mRNA的稳定性及转录效率的改变，也会影响到VDR的表达；rs757343(Tru9I)位点也位于VDR基因第8个内含子，其发生G—A突变，2000年由法国Ye等首先发现并报道，Zajickova等2003年再次证明了此位点的存在，多个研究表明TTT 中文摘要BsmI、ApaI、TaqI、Tru9I这四个位点存在着连锁不平衡(Linkagedisequilibrium，LD)，尤其是BsmI和TaqI之间。BsmI还与位于3’非翻译区的poly(A)存在强烈连锁。目前研究显示VDR的SNP存在改变VDR蛋白的表达或在功能上的改变影响了维生素D活性，另外，由于VDR许多目的基因是通过一个经典的内分泌途径来调控维生素D的代谢，因此VDR蛋白分子或其功能上的任何改变都可能影响维生素D的代谢，从而促成哮喘的发生。近年来，VDR基因多态性在佝偻病、癌症、糖尿病、骨质疏松等疾病已被广泛报告，与哮喘的关系也越来越引起大家的关注。PoonAH等的两项以北美家庭为研究对象的研究中发现VDR基因多态位点与哮喘的具有相关性，rs2228570(FokI)的存在导致第2外显子编码氨基酸密码子427ATG—ACG突变，影响了VDR转录活性；国内，Aaadi、Fang、Li等的三项针对VDR基因常见的多态位点与哮喘的关联研究中未有阳性发现：最近一项来自法国224个家庭的951个哮喘儿童的研究，虽然在VDR基因中发现了13种单核苷酸多态性(包括FokI、BsmI、TaqI)，但是其与哮喘发生之间的联系却不具有统计学意义；而一项在突尼斯儿童对VDR基因的多态性研究中发现，rs2228570(FokI)、rsl544410(BsmI)、rs731236(TaqI)在哮喘组与正常对照组相比差异有统计学意义，增加了儿童发展为哮喘的危险性，而对于rs7975232(ApaI)未发现其与哮喘有相关，该研究还发现BsmI—ApaI—TaqI存在强烈的连锁不平衡，可能影响mRNA的表达和稳定性，改变VDR基因翻译效率及VDR蛋白的表达，从而改变了哮喘患儿的表型。上述研究结果不一致，可能是因为基因的异质性和环境不同所造成。不同人群SNP的分布频率不同，同时哮喘是一种复杂的多基因遗传性疾病，许多基因错综复杂的相互作用及累积效应，使得遗传存在着差异，哮喘的易感性还与环境因素有关，如吸烟(被动或主动)、空气中粉尘、宠物、职业暴露等，这些均可影响实验最终的结果。目前国内外对于rs2228570(FokI)、rs7975232(ApaI)、rsl544410(Bsml)、rs731236(TaqI)、rs757343(Tru9I)基因突变与儿童支气管哮喘的相关性研究报道较少。二．研究目的IV 硕士学位论文本实验通过对哮喘患儿血清中血清25羟基维生素D水平和各T细胞亚群代表性细胞因子的检测，以及哮喘儿童维生素D受体基因多态性分析，拟探讨25一(OH)一VD、Thl／Th2在哮喘发病中的作用，分析哮喘的免疫学发病机制，为哮喘的免疫学治疗方法及其遗传易感性的筛选提供一定的理论和实验依据。三．材料与方法1、研究对象及分组1．1哮喘组2012年3月-2013年6月于本院门诊随诊的40例哮喘患儿(临床缓解期)，男22例，女18例，年龄6个月一3岁，平均(1．91±0．61)岁。其纳入标准均符合2008年中华医学会儿科学会呼吸学组制定的儿童支气管哮喘诊断标准：(1)反复发作喘息、咳嗽、气促、胸闷，多与接触变应原、冷空气、物理或化学性刺激、呼吸道感染以及运动等有关，常在夜间和(或)清晨发作或加剧。(2)发作时在双肺可闻及散在或弥漫性，以呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长。(3)上述症状和体征经抗哮喘治疗有效或自行缓解。(4)除外其他疾病所引起的喘息、咳嗽、气促和胸闷。入组前一周均无使用激素及急性感染病史。1．2对照组：2012年3月-2013年6月于本院健康体检儿童40例，男21例，女19例；年龄6个月一3岁，平均(1．85_+0．59)岁。均无过敏性疾病病史，入组前一周均无使用激素及急性感染病史。1．3所有研究对象均为汉族，在深圳生活的儿童。1．4两组儿童组间性别、年龄差异、维生素D的使用情况均无统计学意义，家长均知情同意参加该项研究。2、标本采集两组儿童均于清晨空腹留取外周静脉血3ml，其中lml，于室温(20一-．25。C)放置60min，2000r／min离心lOmin，制备血清，一70"C冰箱冻存备检。另外2ml，提取全基因组DNA，一20"C冰箱冻存备检。3、血清25-(OH)-VD、IL-4、IL一5、IFN-Y的测定3．1采用酶联免疫吸附(ELISA)试验测定血清25一(0H)一VD、IL一4、IL一5、IFN—YV 中文摘要水平。所有的检测步骤均严格按说明书进行。4、VDR多态位点rs2228570(FokI)、rs7975232(ApaI)、rsl544410(BsmI)、rs731236(TaqI)、rs757343(Tru9I)的检测4．1采用PCR扩增结合DNA直接测序法探测VDR基因有无多态位点rs2228570、rs7975232、rsl544410、rs731236、rs757343存在4．1．1采用苯酚／氯仿提取法提取全基因组DNA。4．1．2设计涵盖VDR多态位点rs2228570、rs7975232、rsl544410、rs731236、rs757343的特异引物。4．1．3扩增目的基因。4．1．4基因测序及序列比对分析3、数据分析应用SPSS13．0软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示，根据方差齐性结果，组间采用两独立样本t或t’检验；计数资料采用卡方检验。P<0．05表示差异有统计学意义。四．结果1、血清25一(OH)一VD、IL一4、IL一5、IFN—Y的测定结果1．1哮喘组与正常对照组比较，25一(OH)一VD水平均低于正常对照组，差异有统计学意义(t=7．498，P75mmol／L(30ng／m1)定义为维生素D水平正常n引。二、支气管哮喘与免疫调节支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T细胞、气道上皮细胞等多种炎性细胞共同参与的气道慢性疾病，免疫功能紊乱是哮喘的重要发病机制之一嵋1， 硕士学位论文其免疫学机制为TH亚群比例失调，即Thl／Th2细胞因子平衡偏移。ThO不能向Thl细胞分化导致IFN-Y减少，而偏向Th2分化导致IL一4、IL一5、IL—13增加，Th2促进B细胞产生大量特异IgE和炎症细胞因子，刺激嗜酸性粒细胞、肥大细胞产生一系列炎症介质如白三烯、内皮素等，诱发变态反应，导致气道高反应性。IL-4是Th2经刺激后产生，在哮喘的发病机制中扮演着重要角色，主要表现在以下三个方面：(1)调节IgE生成。(2)参与气道炎症。(3)参与气道高反应性。IL-5主要来自活化的Th2细胞，具有广泛的生物活性。其作用机制包括：(1)协同IL一4刺激B细胞合成IgEn6|；(2)特异地作用于嗜酸性粒细胞(EOS)，促进肥大细胞、嗜酸性粒细胞的生长和活化，引起EOS反常聚集，促使其释放炎症介质，导致气道炎症和气道反应性增高n71。支气管哮喘的发生还与调节性T细胞(Treg)关系密切。Treg可分为多种不同的亚型CD4+Treg、CD8+Treg、自然杀伤Treg等；又可分为自然Treg(nTreg)和适应调节Treg(aTreg)。nTreg主要是通过细胞与细胞间的作用来抑制T细胞对自身抗原产生免疫应答效应；aTreg则主要是通过分泌IL-IO和转化生长因子B来发挥其调节功能。有研究显示CD4+CD25+Treg能有效地抑制哮喘的发展。Shin印等的研究显示：在急性发作期，哮喘患者血中CD4+CD25+Treg数目明显增加，但在缓解期哮喘及正常人群并不增加；BettelliE等n明对CD4+CD25+Treg缺陷小鼠进行过敏原诱发实验，结果显示其气道反应性明显增加，因此可见CD4+CD25+Treg缺乏者可加重哮喘的发病。维生素D与机体免疫人体免疫应答可分为固有免疫和适应性免疫应答，呼吸道上皮细胞、肺泡巨噬细胞、树突状细胞等参与固有免疫，T细胞、B细胞参与获得性免疫。维生素D被认为在固有免疫和适应性免疫中发挥重要的作用心屹013。在固有性免疫应答中，呼吸道上皮细胞高表达1一Q羟化酶，1，25-OH-D3可以促进由维生素D受体介导的基因表达，包括通过Toll样受体识别病菌，释3 前言放抗菌肽，启动自发性免疫应答，参与对病原体的识别和清除。另外，当上皮细胞受到病毒感染时，1一Q羟化酶的表达增强，产生更多的1，25一(0H)一VD，通过NF—KB信号转导途径调节细胞因子和趋化因子的释放，在不影响病毒清除前提下，减少趋化因子和干扰素的产生，减轻炎症反应；而肺泡巨噬细胞则识别、吞噬、清除抗原瞳2吨3I。在获得性免疫中，维生素D的免疫调节作用主要是通过25一(0H)一VD与有关的细胞上VDR结合来发挥作用，包括与巨噬细胞和树突状细胞(Treg)。自从维生素D受体(vitaminDreceptorVDR)基因被发现是哮喘易感基因后，VD免疫调节作用越来越受关注。25-(OH)一VD通过抑制CD4+细胞的分化，抑制Thl细胞因子的产生，促进Th2细胞因子的产生。25一(oH)一VD对抑制Thl免疫应答的机理已被充分证明，但其对Th2应答的作用复杂，至今未能完全解释清楚乜引。有研究发现，l，25-(OH)-VD打破Thl和Th2细胞因子平衡，使其向Th2偏移，从而导致Thl细胞因子IL一2和IFN—Y分泌减少，Th2细胞因子IL一4、IL一5分泌增加乜5|；而Pichler等的研究显示人外周血CD4+和CD8+细胞中，1，25一(oH)一VD不仅抑制IL-12并刺激IFN—y的产生，还抑制了IL一4和由IL一4诱导的IL一13的表达防271；Taher乜踟等动物实验研究发现，支气管哮喘大鼠出现血清特异性IgE水平增加、支气管肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞增加；用卵蛋白联合1，25一(oH)一VD能降低血清IgE水平、支气管肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞浸润，从而改善气道高反应性。1，25-(OH)-VD影响支气管哮喘发病机制的另一途径是通过对Treg的调节作用。诱导Treg增加Th2细胞因子IL一10、TGF一13的分泌，调节机体免疫功能，对患儿哮喘产生抑制作用。UrryZ等对正常志愿者注射l，25一(oH)一VD，其CD3+、CD4+细胞所表达IL一10和Toll样受体9(Toll—likereceptors9，TLR9)增加凹3；有证据还显示1，25-(OH)-VD对激素抵抗型哮喘患者能增加IL一10的产生，增强激素疗效∞3。IL一10己被证实是一种重要的抗炎细胞因子，可以抑制Th2细胞产生IFN-Y和IL-2，还可以直接抑制或通过抑制IL一5和粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor，GM-CSF)来间接抑制嗜酸性粒细胞生成。维生素D与地塞米松合用能促分裂原活化蛋白激酶一1及4 硕士学位论文IL—IOmRNA的表达量比地塞米松单独作用时显著增多口1|。因Thl7高表达IL一17和TNF参与了免疫反应，1，25-(OH)-VD可直接作用于Thl7，抑制其细胞因子的分泌，1，25-(OH)一VD还可以持续抑制活性B细胞增殖减少浆细胞和记忆B细胞的产生以及Ig—E的分泌，诱导B细胞凋亡∞2J。以上说明1，25一(oH)一VD可能在哮喘免疫调节的各个环节中发挥复杂作用，也揭示了其在哮喘治疗中的潜在应用前景，为进一步探讨1，25-(OH)一VO在哮喘发病中的作用提供充实的理论依据。四、维生素D与哮喘近年来，在世界范围内哮喘的发病不断攀升，儿童维生素D缺乏的现象普遍存在，随着人们对哮喘病因和发病机制的不断深入研究，发现血清维生素D不足或缺乏可能在哮喘发病中有重要的作用。哮喘是由免疫失衡造成的，即Treg细胞和效应性T细胞的失衡。VitD作为免疫系统的一个有选择性的调节剂，影响着Thl／Th2平衡、ThlT／Treg免疫偏移。气道高反应和气道重塑是哮喘的两个重要特征，有研究b31发现维生素D能抑制支气管平滑肌的增生，影响气道的重塑和肺功能。目前众多的流行病学、临床研究表明血清维生素D降低可能会增加感染的机会，增加患儿哮喘的患病率，加重哮喘的恶化，增加住院率、降低肺功能。Sharief∞43等分析了美国2005—2006年的全国健康和营养调查，其中血清VD的水平缺乏(<15ng／m1)的患儿和VD充足的(>30ng／m1)患儿相比较，过敏原阳性率、Ig—E水平都更高。Brehm黯翮等在哥斯达黎加地区对616例年龄在6-14岁的哮喘儿童的一项横断面研究中发现，血清维生素D水平与哮喘发病率、严重程度、住院率、抗炎药物使用、气道高反应性密切相关。Searingb们等在北美100例哮喘儿童横截面研究中发现血清维生素D与肺功能呈正相关，与患儿的总IG—E、过敏程度、吸入或口服激素的使用之间有密切的联系，并增强了使用类固醇激素的效应。Chinellato口73等发现低水平的VD降低患儿的肺功能，它与肺容量(FVC)、第一秒用力肺活量(FEWl)呈正相关，还可能增加了运动诱发气 前言性哮喘的机会。给予维生素D补充治疗可能减少哮喘发作。LeeJS和ZhaoH等船踟的研究表明血清维生素D水平能够提高哮喘或其他有过敏性疾病的患儿抵抗肺炎链球菌的能力。Urashima口明等在一项随机、双盲、对照的临床试验中也显示：在流感季节给予哮喘患儿维生素D补充治疗降低了患儿患季节性流感A的机会，从而大大减少了诱发哮喘的可能。但也有相反的研究结果，比如芬兰H∞的一项研究提出，出生时定期补充VD的婴儿(200IU／日)将来易患哮喘、变态反应性疾病、过敏性鼻炎的风险高于没有被补充的婴儿；瑞典H13的研究也显示对满5月的婴儿每天给予维生素D(>400IU)的6岁时患湿疹的可能性大。因而对于25一(OH)．VD的看法尚存在不同意见。五、维生素D基因多态性在哮喘中的研究现状维生素D是人体必需的一种维生素，属于脂溶性维生素，也是一种类固醇激素。影响血清维生素D水平除了与日照时间、饮食等因素有关外，还与遗传因素密切相关。目前已发现了大量的与维生素D代谢及作用途径中相关的基因多态性，如细胞色素P4502R1(CYP2R1)基因、维生素D(VDR)基因、GC一球蛋白(GC)基因、细胞色素P45024A1(CYP24A1)基因等的突变可导致维生素D水平的异常。目前研究最多的是CYP2R1基因、VDR基因。维生素D的功能发挥主要是通过维生素D受体来介导的，因而对VDR的研究近年来越来越受到关注。维生素D在血中的活性形式是1，25(0H)2D3，也是维生素D受体(VDR)的主要配体。VDR是类固醇激素／甲状腺激素受体超家族成员，是一种配体依赖性的转录因子。有两个主要的功能区：一个DNA结合区(DBD)和一个配体结合区(LBD)。DBD定位在VDR的N一末端，由VDR外显子II、III编码，为核受体家族的特异性蛋白质，具有高度保守性，是VDR作为转录因子发挥作用必须的。LBD定位在VDR的C一末端，由VDR外显子V一工X编码，该区是与1， 硕士学位论文25-(OH)-VD结合的主要部位，能维持1，25-(OH)-VD强大亲和力和促进二聚体的形成H引，增强其与VDR应答元件(VDRE)的结合能力。1，25一二羟维生素D的生物效应主要是通过基因与非基因组两种机制介导H引。基因组机制依赖于细胞核内的特异性受体(VDR)，VDR通过LBD区特异性地结合配体1，25一(oH)一VD，形成受体一激素复合物。通过DBD区识别DNA上的VDRE，在共激活子、各种转录因子及RNA聚合酶的共同作用下，形成转录复合物，调控结构基因的表达。非基因组机制即是1，25一(0H)一VD能够通过跨膜信号传导引起一些快速的生物学效应。通过上述两种机制，VDR与125-(OH)-VD结合被活化后，在体内具有多种生物活性，参与维持机体钙、磷代谢，调节多种细胞的增殖分化，并具有免疫调节、抑制肿瘤、抗炎等作用。VDR于1988年被克隆出来，其位于人12号染色体长臂上，长度总长75Kb(Miyamoto等．1997)，包括9个编码的外显子和8个内含子，共编码427个氨基酸，分子量为50KD，5端非编码区包括1A、1B、1C外显子，2—9号外显子编码基因的蛋白产物。VDR在人体各组织细胞中广泛存在，除了传统的肠道、肾脏、骨骼等靶器官外，它还存在于肿瘤组织(乳腺癌、白血病细胞等)、血液、淋巴、泌尿生殖、神经系统等H4|，许多免疫细胞中都发现有VDR口5l。VDR是核内生物大分子，分为两大类即膜受体(mVDR)和核受体(nVDR)，前者主要参与钙磷平衡的维持，后者通过调节Th细胞的发育和Th细胞因子谱的表达。现已证明，大多数免疫细胞都有VDR的表达，包括T细胞、B细胞、NK细胞以及抗原递呈细胞等，可通过活化Treg或T细胞受体表达来调节免疫反应。哮喘是一种复杂的由环境和遗传共同作用的疾病乜3，发病呈现多因性和异质性，并由不同的遗传机制控制。至今，其临床预后仍然不尽人意，因此，寻找哮喘的易感基因进而探索其发生的分子机制是防治哮喘的根本途径。目前研究发现，哮喘与1、5、6、11、12、14、16号染色体相关，VDR定位于12号染色体，被发现在气道上皮细胞有表达，目前多项研究显示1，25(oH)2D和VDR的遗传变异(SNPs)与发生哮喘的危险性密切相关，VDR基因是观察哮喘基因非常好的候选者H6I。主要可能是VDR的SNP存在改变VDR蛋。白的表达或在功能的改变使得维7 前言生素D活性发生异常，另外，由于VDR许多目的基因是通过一个经典的内分泌途径调控维生素D的代谢H7|，因此VDR蛋白分子或其功能上的任何改变都可能影响维生素D的代谢。VDR基因多态性在佝偻病、癌症、糖尿病、骨质疏松等疾病已被广泛报告，与哮喘的关系备受大家的关注。Wittke等H83的研究表明维生素D受体缺乏的小鼠不能发展成为实验性过敏性哮喘，将足够数量的VDR敲除小鼠的免疫细胞移植回野生型小鼠体内，可以使野生型小鼠产生哮喘症状。Bosse等H钉分析维生素D受体配基1-25(OH)2D3具有可参与多细胞多效性的功能，且维生素D受体可引起气道平滑肌的病理改变，这也许是VDR引起哮喘的原因。常用的遗传变异研究方法包括基因组扫描法、基因组筛查法、定位克隆和候选基因法，候选基因法是采用病例一对照的关联研究方法，所需样本相对较少，并且更易于揭示疾病的本质。SNPs作为第三代遗传标志系统因其高密度的特点也被大量应用于哮喘遗传学机制的研究。SNPs主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性，并且这种变异在人群中出现的频率大于1％。SNPs差异代表某一种族或人群间的遗传差异，可能直接影响到蛋白质结构或表达水平，从而产生遗传易感性。目前检测基因多态性常用的方法有PCR-RFLP、PCR-单链构象多态性及直接测序分型方法。VDR基因常见的单核苷酸多态性位点(SNP)有FokI(rs2228570)、BsmI(rsl544410)、Tru9I(rs757343)、ApaI(rs7975232)和TaqI(rs731236)5个位点，分别位于第2外显子、第8内含子和第9外显子，及在3’端下游区域的poly—A多态性嘲1。在不同人群和种族中的研究有两项来自北美洲以家庭为基础的不同研究显示哮喘与VDR基因多态性相关喳卜521，rs2228570(FokI)位点位于第2外显子，是唯一影响编码蛋白基因，其多态性是由于第1个起始密码子ATG上的T—C变异形成的。导致编码氨基酸密码子427ATG—AcG突变，使得翻译起始位点位于3个密码子以后，即翻译的蛋白质少3个氨基酸，为424个氨基酸，突变型CC使得VDR转录效率大大增强；但是，另一个来自德国人的报告却没有显示这种关联碡31。另有多个研究啼椭71表明rsl544410(BsmI)、rs79752328 硕士学位论文(ApaI)、rs757343(Tru9I)虽位于内含子区域，但其序列改变可能影响mRNA的稳定性，且Bsml、Apal、TaqI、Tru9I之间存在着连锁不平衡，从而影响了VDR的表达效应，造成表型的显著改变。目前关于VDR基因多态性与哮喘特别是儿童哮喘的发病机制研究不多。而对VDR基因型与哮喘相关性的研究，将有助于从基因水平认识疾病的发病机理，并且可为疾病的治疗和预防提供新的途径。六、本研究的依据及内容国内外研究发现维生素D及其受体与TH细胞因子失衡、哮喘发生有着密切联系，。维生素D受体存在多个多态位点，和许多疾病相关联。本实验拟对哮喘儿童及健康儿童，应用酶联免疫吸附试验技术检测血清细胞因25一(OH)-VD、IL-4、IL一5、IFN—Y水平，应用DNA测序法检测VDR常见多态位点(rs2228570、rs7975232、rsl544410、rs731236、rs757343)，探讨维生素D及其受体与儿童支气管哮喘的相关性，以及对IL一4、IL-5、IFN-Y等细胞因子在哮喘发病中的影响作用，从遗传学和免疫学角度分析哮喘的发病机制，为寻找抑制气道炎症的药物及遗传易感性的筛选提供理论和初步实验依据。【1】．【2】．参考文献TseK，HomerAA．Allergentoleranceversustheallergicmarch：thehygienehypothesisrevisited．CurrAllergyAsthmaRep，2008，8：475-483．‘(CDC)CfDCaP．Vitalsigns：asthmaprevalence，diseasecharacteristics，andself-managementeducation：UnitedStates，2001-2009．MorbMortalWklyRep2011；60：547-552．MoormanJE，ZahranH，TrumanBI，MollaMT．Currentasthmaprevalence：UnitedStates，2006-2008．MMWRSurveillSumm2011；60(Suppl17)：84·86．9 前言【4】．安淑华，王艳艳，宋庆，等．儿童哮喘相关因素logistic回归分析I-J-I．临床儿科杂志，2010(5)：455-458．【5】．HolgateST．Innateandadaptiveimmuneresponsesinasthma[J]．NatMed，2012，18(5)：673-683．[6】．CooperMA，FehnigerTA，CaligiuriMA．Thebiologyofhumannaturalkiller-cellsubsetsv[J]．TrendsImnaunol，2001，22(38)：633-640．[7】．【8】．【9】．【10]．【12]．[131．【14]．【151．【16]．【17]．【181．【19]．【20]．【21]．MakG，HananiaNA．VitaminDandasthma[J]．CurrOpinPulmMed，2011，17(1)：l-5．HolickMF．VitaminDdeficiency[J]．CAllergyClinImmunol，2011,24(4)：176-180．PaulG，BrehmJM，AlcomJF，eta1．VitaminDandasthma[J-I．AmJRespirCfitCareMed，2012，185(2)：124-132，VanEttenE，StoffelsK，GysemansC，eta1．RegulationofvitaminDhomeostasis：implicationsfortheimmunesystem．NutrRev,2008，66(10Suppl2)：S125·S134．Kuro—OM．Klothoinchronickidneydisease．Whatisnew．NephmlDialTransplant．2009，24(6)：1705-1708．HolickMF．ResurrectionofvitaminDdeficiencyandrickets[J]．C1inicalInvestigation,2006，116(8)：2062·2072．HolickMF。VitaminDDeficiency[J]。TheNewEnglandJournalMedicine，2007，357(3)：266．281．NieldLS，MahajanP，JoshiA，eta1．Rickets：notadieasesofpast[J]．AmericanFamilyPhysician，2006，74(4)：619—626．HolickMF．VitaminDdeficiencyEJ-I．NEnglJMed，2007，357(3)：266-281．MenziesGowA，RobinsonDS．Eosinophils，eosinophiliccytokines(interleukin-5)，andantieosinophilictherapyinasthma[J】．CurrOpinPulmMed，2002；8：33—38．赵宏霞，庄哈娜，柯宇星，等支气管哮喘患儿血清白细胞介素．4、白细胞介素．5和C干扰素水平检测的意义[J]．实用儿科临床杂志，2011,26(4)：270．271．ShiHZ，LiS,XieZF，eta1．RegulatoryCIM+CD25+Tlymphoeytesinperipheralbloodfrompatientswithatopicasthma．ClinImmunol，2004．113(2)：172·178．Lew．kowichIP,HermanNS，SchleiferKWeta1．CD4+CD25+Tcellsprotectagainstexperimentallyinducedasthmaandalterpulmonarydendriticcellphenotypeandfunction【J】．JExpMed，2005；202(11)：1549-1561．GindeAA，SutherlandER．VitaminDinasthma：panaceaortruepromise?JAllergyClinImmunol2010；126：59-60．LangeNE，LitonjuaA，HawrylowiczCM，WeissS．VitaminD，theim—munesystemandlO 硕士学位论文[22]．[231．【24]．[25]．[26]．【27]．[28]．【29]．【301．【3l】．【321．【33]．asthma．ExpertRevClinImmunol2009；5：693—702．HansdottirS，MonickMM，HindeSL，eta1．RespiratoryepithelialcellsconvertinactiveVitaminDtoitsactiveform：Potentialeffectsonhostdefense．JImmunol，2008，181：7090·7099．HansdoairS，MonickMM，LovanN，PowersL，GerkeA，HunninghakeGW．VitaminDdecreasesrespiratorysyncytialvirusinductionofNF··kappaB--linkedchemokinesandcytokinesinairwayepitheliumwhilemaintainingtheantiviralstate．JImmunol2010；184：965-974．TabackSP，SimonsFE．AnaphylaxisandvitaminD：aroleforthesunshinehormone?JAllergyClinImmun01．2007，120：128-130．MatheuV，BackO，MondocE，etat．DualeffectsofvitaminD-inducedalterationofTHI／TH2cytokineexpression：enhancingIrEproductionanddecreasingairwayensinophiliainmurineallergicairwaydiseaseAllergyClinlmmunol，2003，l12：585·592．PichlerJ，GerstmayrM，SzepfalusiZ，UrbanekRPeterlikM，WillheimM．1Alpha,25(OH)2D3inhibitsnotonlyThlbutalsoTh2differentiationinhumancordbloodTcells．PediatrRes．2002；52(1)：12·18．Annesi-MaesanoI．Perinatalevents，vitaminD，andthedevelopmentofallergy．PediatrRes．2002；52(1)：3——5．TaherYA，VanEachBC，HofmanGA，eta1．1alpha,25-dihydroxyvitsminD3potentiatesthebeneficiMeffectsofallergeninmmnothempyinamousemodelofallergicasthma：roleforIL·10andTGF-beta．JImmunol，2008，180(8)：521l一5221．UrryZ，XystrakisE，BichardsDF，eta1．LigaltionofTLR9inducedonhumanIL-10-secretingTreguby1,25-dibydrexyvitaminD3abrogatesregulatoryfunction．JClinInvest，2009，119：387-398．XystrakisE，KusumakarS，BoswellS，eta1．ReversingthedefectiveinductionofIL·10-secretingregulatoryTcellsinglucocorticoid-resistantasthmapatients．JClinInvest．2006；116(1)：14¨5FrieriM．111eroleofvitaminDinasthmaticchildren．CurrAllergyAsthmaREP，201l，11：1-3．ChenS，SimsGP，ChenXX，eta1．Modulatoryeffectsof1,25·dihydroxyvitaminD3onhumanBcelldifferentiation．JImmunol，2007，l79(3)：1634-1647．GuptaA，SjoukesA，RichardsD，eta1．RelationshipbetweenserumvitaminD，diseaseseverityandairwayremodelinginchildrenwithasthma．AmJRespirCritCareMed2011；184：1342．1349． 前言【34]．[351．[36]．【37]．【38]．【39]．【40]．【41]．[42】．[43]．[44】．【45]．【46]．【47]．Sh撕efS，JariwalaS，KumarJ，eta1．VitaminDlevelsandfoodandenviron-mentalallergiesintheUnitedStates：resultsfromtheNationalHealthandNutritionExaminationSurvey2005-2006[J]．AllergyClinImmunol2011；127：1195-1202．BrehmJM，CeledonJC，Soto—QuirosME，AvilaL，HunninghakeGM，FomoE，LaskeyD，SylviaJS，HollisBW,WeissST,eta1．SerumvitaminDlevelsandmarkersofseverityofchildhoodasthmainCostaRica．AmJRespirCritCareMed2009；179：765-771．SearingDA，ZhangYMurphyJR,HaukPJ，GolevaE，LeungDY．DecreasedserumvitaminDlevelsinchildrenwithasthmaareas-sociatedwithincreasedcorticosteroiduse．JAllergyClinImmunol2010：125：995一1000．ChinellatoI，PiazzaM，SandriM，eta1．SerumvitaminDlevelsandexercise-inducedbmnchoconslrictioninchildrenwithasthma．EurRespirJ2011；37：1366-1370．LeeJs，ZhaoH，FentaY,KitaH，KumarR，JuhnYJ，Serum25一hydroxyvitaminDisassociatedwithenhancedpneumococcalantibodylevelsinindividualswithasthmaAllergyAsthmaProc，2011，32(6)：445-452．UrashimaM，SegawaT，OkazakiM，eta1．RandomizedtrialofvitaminDsupplementationtopreventseasonalinfluenzaAinschoolchildren．AmJClinNutr2010；91：1255．1260．HypponenE，SovioU，WjstM，eta1．InfantvitaminDsupplemen-tationandallergicconditionsinadulthood：northernFinlandbirthcohortl966[J]．AnnNYAcadSci，2004，1037：84-95．BackO，BlomquistHK，HemellO，eta1．DoesvitaminDintakeduringinfancypromotethedevelopmentofatopicallergy[J]．ActaDermVenereol，2009，89：28—32．HolickMEVitaminDdeficiency[J]．NEnglJMed,2007，357(3)：266-281．AritaK，NandaA，WessagowitVeta1．AnovelmutationintheVDRgeneinhereditaryvitaminDresistantfickets[-J]．BritishJournalofDermatology,2008，158(1)：168-171．ChunRF．AdamsJS．HewisonM，ela1．Backtothefuture：anewlookatoldvitaminD．JEndocdn01．2008，198(2)：261-269．YlikomiT，LaaksiI,RulouY，eta1．Antipolifemtiveactionofvita．minD[J]．VitaminsandHormones，2002，64：357-406．BikleD．NonclassicactionsofvitaminD[J]．JClinEndocfinolMetab，2009，94(1)：26--34．BemdtA，SavageHS，SteamsTM，PaigenB．Geneticanalysisoflungfunctionininbredmice§uggestsvitaminDreceptorasacandidategene．MolGenetGenomics】2 硕士学位论文2011；286：237-246．[48]．AndersonPH，MayBK，MomsHA．VitaminDmetabolism．Newconceptsandclinicalimplications．ClinBiochem2003；24：13-26．[49]。[50]．【5l】．【52]．【53]．[541．【55]．【56]．【57]．【58]．WittkeA，WeaverVMallonBD，etal1VitaminDreceptor—deficientmicefailtOdevelopexperimentalallergicasthma【J】．JImmunol，2004，173(5)：3432-3436．BossYMaghniK，HudsonTJ，eta1．Ialpha,25一dihydroxyvitaminD3stimulationofbronchialsmoothmusclecellsinducesautocrine，contractility,andremodelingprocesses[J】．PhysiolGenomics，2007，29(2)：161-168．JunSun．VitaminDandmucosalimmunefunction[J]。CurrOpinGastroenterol，2010，26(6)：591-595．RabyBA，LazarusRSilvermanEK，LakeS，LangeC，WjstM，eta1．AssociationofvitaminDreceptorgenepolymorphismswithchildhoodandadultasthma．AmJRespirCritCareMed2004；170(10)：1057--65．PoonAH，LapriseC，LemireM，MontpetitA，SinnerD，SchurrE，eta1．AssociationofvitaminDreceptorgeneticvariantswithsusceptibilitytoasthmaandatopy．AmJRespirCritCareMed2004；170(9)：967-73．WjstM．VariantsinthevitaminDreceptorgeneandasthma．BMCGenet2005；15(6)：2．HayesCE，NasholdFE，SpachKM，PedersenLB．TheimmunologicalfunctionsofthevitaminDendocrinesystem．CellMolBiol2003；49：277-300．FluggeJ,KrusekopfS,GoldammerM，eta1．VitaminDreceptorhaplotypesprotectagainstdevelopmentofcolorectalcancer．EarJClinPharmac01．2007．63：997-1005．InglesSA，HaileRW，HendersonBE，eta1．StrengthoflinkagedisequilibriumbetweentwovitaminDreceptormarkersinfiveethnicgroups：implicationsforassociationstudies．CancerEpidemiolBiomarkersPrey，1997，6：93·98．UitterlindenAG，FangY，VanMcurJB，eta1．GeneticsandbiologyofvitaminDreceptorpolymorphisms．Gene，2004，338：143-156．13 前言实验技术路线14 硕士学位论文一、主要试剂材料与方法TriS碱(pH8．0)Sigma．COEDTAGenview．COSDSSigma．CO蛋白酶KSigma．CO乙酸钙北京北化公司醋酸钠北京北化公司苯酚北京北化公司氯仿北京北化公司异戊醇北京北化公司醋酸钠北京北化公司NaCl北京北化公司KCl北京北化公司Na2HP04北京北化公司KH2P04北京北化公司Taq聚合酶上海生工生物工程公司dNTP混合物上海生工生物工程公司引物上海生工生物工程公司10×Buffer上海生工生物工程公司M92+上海生工生物工程公司琼脂糖BIO．CO溴化乙锭Sigma．CO硼酸北京北化公司PCR产物回收试剂盒(离心柱型)上海华舜生物工程公司BigDye荧光标记物终止底物循环测序试剂盒PEABI．CO细胞因子(25-(OH)一VD、IL一4、IL一5、IFN—Y)ELISA检测试剂盒上海生工生物工程公司15 材料与方法二、主要溶液配制1、细胞裂解液1MTris—CI(pH8．0)0．5ml0．5MEDTA(pH8．0)lOmlIO％SDS2．5ml双蒸水37ml2、PBS缓冲液NaCl89KCl0．29Na2HP041．449KH2P040．249加双蒸水至lOOml，调pH值至7．4，高压灭菌，4。C保存备用3、IO％SDSSDSlg加双蒸水至lOml，68℃加热促溶冷却后加浓盐酸，调pH值至7．2，4。C保存备用4、蛋白酶K(20mg／L)0．1MTriS0．5ml15mmol／L乙酸钙0．1ml蛋白酶K20mg双蒸水0．4ml5、3M醋酸钠(NaAc)醋酸钠40．89加双蒸水至100M加入冰醋酸调pH值至5．2，高压灭菌备用6、10×TE缓冲液1MTris—CI(pH8．0)0．5ml0．5MEDTA(pH8．0)0．1ml双蒸水49．4ml7、5×TBE缓冲液TriS碱2790．5MEDTA(pH8．0)lOml硼酸13．759双蒸水定容于500ml8、醋酸钠／乙醇混合液无水乙醇37．5ml3M醋酸钠2．5ml16 硕士学位论文三、主要仪器二、土炭仪帑普通冰箱一80。C低温冰箱DK一8D电热恒温水浴箱台式冷冻高速离心机DYY—III型稳压稳流电泳仪DYY一ⅡI型电泳槽(水平式)ND一1000分光光度计BioTekElx800通用酶标仪M订1iporeE1ix纯水系统ABIPRISM310型DNA测序仪芬兰雷勃MK2洗板机SpectraMaxM5多功能酶标仪四、实验方法步骤青岛海尔sanyoElectric．CO上海棱潜仪器仪表公司sanyoElectric．CO北京百晶生物技术公司Nanodrop．CO．Gene．COMillipore。COPEABI．COThermoLabsystems美国MolecularDevices1．研究对象及分组1．1哮喘组：2012年3月-2013年5月于本院门诊随诊的40例哮喘患儿(临床缓解期)，男22例，女18例，年龄年龄6个月一3岁，平均(1．91±0．61)岁。其纳入标准均符合2008年中华医学会儿科学会呼吸学组制定的儿童支气管哮喘诊断标准：(1)反复发作喘息、咳嗽、气促、胸闷，多与接触变应原、冷空气、物理或化学性刺激、呼吸道感染以及运动等有关，常在夜间和(或)清晨发作或加剧。(2)发作时在双肺可闻及散在或弥漫性，以呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长。(3)上述症状和体征经抗哮喘治疗有效或自行缓解。(4)除外其他疾病所引起的喘息、咳嗽、气促和胸闷。入组前一周均无使用激素及急性感染病史。1．2对照组：2012年3月-2013年5月于本院健康体检，JL童40例，男2l例，女19例；年龄6个月一3岁，平均(1．85+0．59)岁。均无过敏性疾病病史，入组前一周均无使用激素及急性感染病史。1．3所有研究对象均为汉族，。在深圳生活的儿童。17 材料与方法1．4两组儿童组间性别、年龄差异、维生素D服用情况均无统计学意义(P>O．05)，家长均知情同意参加该项研究。2．标本采集哮喘组及对照组儿童均于清晨空腹留取外周静脉血3ml，其中Iml置含z,--胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)的抗凝管中，室温(20～254C)放置60min，2000r／min离心lOmin，留取血清，一70。C冰箱冻存备检；另外2ml，提取全基因组DNA，一20℃冰箱冻存备检。3．25-(OH)-VD、IL-4、IL-5、IFN—Y的测定3．1测定步骤采用ELISA方法。所有的检测步骤均严格按说明书操作。具体操作步骤如下：1．标准品的稀释：6000ug／L5号标准品120u1的原倍标准品加入120u1标准品稀释液3000lag／L4号标准品120ul的5号标准品加入120lJl标准品稀释液1500|lg／L3号标准品120ul的4号标准品加入120ul标准品稀释液750IJ,g／L2号标准品120u1的3号标准品加入120ul标准品稀释液375ug／Ll号标准品120ul的2号标准品加入120IJ1标准品稀释液2．根据代测样品数量50个加上标准品的数量5准备所需的板条数。每个标准品和空白孔做复孔。3．加样：1)空Ih-孑L，空白对照孔不加样品，生物素标记的抗体，链霉亲和素一HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同；2)标准品孔：加入标准品50ul，链霉亲和素一HRP50ul(标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加)；3)代测样品孔：加入样本40ul，然后各加入抗体lOul、链霉亲和素一HRP50ul，盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37℃温育60分钟。4．配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。5．洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去， 硕士学位论文如此重复5次，拍干。6．显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。7．终止：每孔加终止液50u1，终止反应(此时蓝色立转黄色)。8．测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。9．根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。3．2统计学处理检测结果以均数±标准差(i±S)表示，采用SPSS13．0统计软件进行统计学分析，计数资料根据方差齐性结果分别采用t或t’检验，以P3％，并且半数以上儿童近12个月内仍有喘息、夜间干咳、运动后干咳等哮喘症状。哮喘是当今世界威胁公共健康的最常见的慢性肺部疾病，儿童是其发病的常见群体，哮喘的反复发作易导致肺功能的下降，给儿童的生活质量和身心健康带来极大的危害。维生素D缺乏或不足已经成为一个世界范围的公共卫生问题。流行病学研究也显示维生素D可能在哮喘发生、发展过程中起重要的作用。一、维生素D的免疫调节作用大部分哮喘属于过敏性哮喘，其发病与接触变应原有关。变应原进入机体后，由抗原呈递细胞(antigenpresentingcell，APC)将抗原呈递给T淋巴细胞，使CD4+T淋巴细胞活化并向Th2细胞优势分化，导致Thl／Th2比例失调，即Th2功能亢进导致相关细胞因子分泌的大量增加。血清25羟维生素D3是维生素D3的生理活性代谢产物，属开环甾类化合物激素，血清25羟维生素D3除了具有调节钙和骨代谢外，更通过其受体(VDR在各种有核细胞上均有表达)的共同参与，形成配体一受体效应，调节多种炎症细胞因子所表达的细胞信号通路，具有广泛的生物学活性，如通过影响DC活化，细胞受体表达和对Thl／Th2平衡进行调节影响免疫反应，因而被认为是一种重要的免疫功能调节剂H1。与固有免疫和适应性免疫均有密切关系陆1。树突细胞及调节T细胞在哮喘发病中发挥重要的作用，而维生素D3就是通过活化树突状细胞和T细胞来调节免疫。29 讨论单核细胞／巨噬细胞是固有性免疫的重要组成部分，25(0H)VD是固有性免疫应答的调节者之一。25(OH)VD一方面通过介导单核细胞进一步分化成熟为巨噬细胞，刺激巨噬细胞产生免疫抑制剂前列腺素E2，下调GM—CSF的表达，以及抑制巨噬细胞分泌炎症因子和趋化因子∞1；另一方面直接调节抗微生物肽基因表达，上调抗菌肽和B一防御素2(B-defensins2)的表达，从而调节固有性免疫应答反应口1。DCs是目前发现的体内功能最强大25一(oH)一VD专职的抗原递呈细胞，参与抗原的识别、加工处理与递呈，主要功能是诱导产生免疫反应和诱导免疫耐受，维生素D3能够抑制DCs分化，多途径诱导T细胞免疫耐受∞1。PennaG啤1等的实验证明l，25(OH)VD及其合成类似物能抑制体外诱导的单个核细胞来源的DC分化和成熟，保持未成熟的状态，使其能下调共刺激分子以及主要组织相容性复合体一II(Majorhistocompatibilitycomplex—II，MHCII)的表达，抑$!JIL-12p75的基因表达，从而减少IFN-Y、IL-12的分泌，增2HIL-IO的分泌，促进DC的自发性凋亡，抑制DC抗原提呈功能，间接地抑制了Thl反应。Urry等n町研究发现在地塞米松和维生素D的共同刺激诱导CD4+Tregs细胞可以分泌高水平的IL-10，提示Tregs细胞能参与抑制过敏和哮喘疾病发病机制中的免疫反应能力。而且过敏原的刺激后分泌IL一10的Treg细胞以一种IL-IO依赖的方式抑制抗原诱导的Th2分泌的细胞因子。维生素D还能够阻止单核细胞分化为DCs，阻止幼稚DCs分化为成熟DCs，减少IL-12分泌，增力HIL-IO的产生。因此，有研究n13对激素抵抗型哮喘患者1，25-(OH)-VD能够诱导Treg细胞分泌IL-IO增加而逆转激素抵抗，提高治疗作用。CD4+T细胞分为Thl、Th2、调节性T细胞(Treg)、THl7四个主要亚群，支气管哮喘与CD4+T细胞亚群比例失衡密切相关。即Thl／Th2细胞因子平衡偏移是哮喘的重要发病机制。ThO不能向Thl细胞分化致IFN-y、IL-12、IL-2减少，而向Th2分化致IL一4、IL一5增加，Th2促进B细胞产生大量特异性IgE和炎症细胞因子，刺激嗜酸性粒细胞、肥大细胞，产生一系列炎症介质如白三烯、内皮素、前列腺素等，进入肺组织促进黏液分泌，引起气道炎症，导致机体的变态反应。IL-4在哮喘的发病机制中扮演着重要角色，对肥大细胞的生长、Thl／Th2细胞的分化30 硕士学位论文有重要作用，促进Th2细胞分化，同时抑SUThl细胞的分化n刮。主要表现在以下三个方面(1)调节IgE生成。(2)参与气道炎症。(3)参与气道高反应性。IL-4在哮喘的发病中具有重要作用，与哮喘的严重程度存在正相关性。IL-5亦是哮喘炎症中的主要调节因子，其作用机制包括(1)协同IL一4刺激B细胞生成大量IgEn3|：(2)特异地作用于EOS，促进肥大细胞、嗜酸性粒细胞的生长和活化，引起EOS反常聚集，促使其释放炎症介质，导致气道炎症和气道反应性增高n4I。IL一5对儿童哮喘起正性调节作用，目前针对抗IL一5抗体的研究正处于临床试验之中。最近国外的研究n5‘173表明，这种人化的单克隆白细胞介素5抗体(如mepolizumab)能够减少哮喘病人外周血和痰嗜酸性细胞计数，减少一些严重哮喘(激素抵抗型的嗜酸性粒细胞哮喘)的病人的急性加重，但对临床症状、肺功能、气道高反应性等参数仍需进一步观察研究。众多研究证实，1，25一(OH)一VD作为一种新的神经内分泌一免疫调节激素，在T细胞及单核细胞两个水平上影响细胞因子的分泌，并对Thl、Th2型细胞因子产生不同的调节效应，选择性抑制Thl型细胞因子，使IL一2和IFN—y的分泌减少，从而改善哮喘患者Thl与Th2细胞因子网络失衡。IFN—Y的转录受抑制可能是由于VDR／维甲酸X受体(retinoidXreceptor，RXR)复合物和沉默子区域、一小部分启动子区域结合，从而阻碍了转录的起始和延伸n引。研究n们发现l，25-(OH)-VD能有效抑制肺组织及支气管肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞(EOS)的聚集及IL-5的表达，从而改善哮喘气道炎症反应；它还能通过抑制IL一4的生成及抑制T细胞向二级淋巴结的归巢在哮喘中发挥抗炎作用。二、血清维生素D水平与哮喘的关系．维生素D不仅参与Thl／Th2的免疫调节系统，影响Thl／Th2免疫偏移乜㈣2|，更通过其受体的共同参与，形成配体一受体效应，通过复杂机制影响机体气道慢性炎症。流行病学研究也表明，哮喘儿童大多存在维生素D的不足或缺乏，补充维生素能改善哮喘儿童的临床状况，维生素D可能参与了儿童哮喘发病机制。维生素D与哮喘发病关系主要有以下三个方面：(1)维生素D不足大大降低呼31 讨论吸道抵抗感染的能力，呼吸道感染可能诱发哮喘急性发作或加重。在儿科的一项研究Camargo乜33等对新西兰922个新生儿的观察中发现脐带血中低水平的维生素D增加了他们三个月时患呼吸道疾病的机率。Urashima口41等在一项随机、双盲、对照的临床试验中也显示：在流感季节给予哮喘患儿维生素D补充治疗降低了患儿患季节性流感A的机会，从而大大减少了诱发哮喘的可能。(2)维生素D不足影响肺部功能。Chinellato乜H63等发现低水平的VD降低患儿的肺功能，与肺容量(FVC)、第一秒用力肺活量(FEVl)呈正相关，哮喘控制良好的患儿往往血清中25一OH—D3水平更高。他们对同组研究对象在随后的研究中又发现患儿运动后支气管的反应和维生素D浓度密切相关。Zosky等乜73的动物实验也支持了这一观点。(3)维生素D不足可能参与气道重塑。气道重塑是哮喘慢性化、持续化、严重化的重要病理基础，是导致肺功能下降的直接原因。维生素D心胡已经被证明能够影响支气管平滑肌的微阵列基因的信号表达，影响支气管平滑肌细胞生长、存活、细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)的形态形成进而影响气道重构。有研究乜明证明维生素D能够抑制体外培养的被动致敏人哮喘ASM细胞增殖；还能下调基质金属蛋白酶一9(matrixmetalloproteinase，删P一9)表达口引，从而改善气道重构。基质金属蛋白酶9(删P一9)是特异性降解ECM的锌依赖性蛋白酶家族，删P一9的过度表达不仅能导致ECM结构重塑，而且还能诱导嗜酸粒细胞迁移并影响气道平滑肌细胞增殖与迁移，在气道重塑中有重要作用。而核因子KB(nuclearfactor-Kb，NF-KB)现已被证明是MMP-9的基本转录调控因子，它通过结合MMP-9基因启动子部位的KB位点来调控姗卜9的基因转录及表达，是哮喘发病机制中最受关注的信号转导系统，参与气道炎症和重塑的多个环节口1l。由此可见，维生素D可能通过抑制NF_KB活化来下调哮喘肺组织中删P一9的表达，从而在减轻哮喘气道重塑方面发挥重要作用。另外维生素D缺乏与不足的患儿口21则可能表现为肺功能低下的顽固性哮喘以及对激素治疗的不敏感。而NF—KB持续性过度激活不仅是重度哮喘的重要特征，同时也是激素临床疗效的重要影响因素口引。国内陈凌燕等口钔通过在大鼠孕期和哺乳期给予不同剂量维生素D干预，发现孕期及哺乳期补充适量维生素D可减少 硕士学位论文子代大鼠哮喘模型维生素D受体(VDR)的表达，减轻气道炎症反应，但过量补充维生素D则增加VDR表达，可能加重气道炎症反应。也有研究表明生命早期给予补充VD口51可减少出生后患喘息性疾病的机会，利用维生素D治疗儿童哮喘疗效显著，推测可能是VD具有介导单核细胞进一步分化成熟成为吞噬细胞的调节作用，并能促进单核／吞噬细胞的作用或调节被激活的T细胞，VD轻度缺乏或不足可能会降低机体正常的免疫功能，导致哮喘容易反复发作。本实验采用ELISA的方法25一(oH)一VD检测哮喘患儿和正常患儿的血清25一(OH)-VD浓度后发现，哮喘患儿25一(OH)--VD水平降低，哮喘患儿Thl相关因子IFN-Y降低，Th2相关因子IL一4、IL-5升高，提示哮喘患儿可能存在维生素D不足或缺乏，THI／TH2的失衡，两者可能有相关性，结果符合国内外相关报道。三、维生素D基因与哮喘的相关性影响血清维生素D水平除了与日照时间、饮食等因素有关外，还与遗传因素密切相关。维生素D代谢及作用途径中相关的基因如细胞色素P4502RI(CYP2RI)基因、维生素D(VDR)基因、GC-球蛋白(GC)基因等的多态性已可能影响血清维生素D水平。目前研究最多的是CYP2RI基因、VDR基因。1，25(OH)一VD发挥有关的生物学效应主要是通过VDR来介导的，其作用机制：其与VDR结合形成激素一受体复合物，该复合物与VDR上的激素反应元件结合，再通过与其他调节因子相互作用，从而实现对VDR基因表达的调控，发挥其免疫调节功能mq7|。现有研究证明VDR基因多态性的存在可能影响1，25(OH)一VD的发挥免疫调节作用，并由此可能诱发或加重某些疾病。因而对VDR的研究近年来备受关注。VDR于1988年被克隆出来，荚位于人12号染色体长臂上，长度总长75Kb(Miyamoto等．1997)，包括9个编码的外显子和8个内含子，共编码427个氨基酸，分子量为50KD，5端非编码区包括1A、lB、1C外显子，2-9号外显子编码基因的蛋白产物。VDR为亲核蛋白，位于细胞核内，属于配体依赖的类固醇激素／甲状腺激素受体超家族的成员，维生素D的代谢产物维生素D3即l，33 讨论25(OH)-D3，后者是与VDR结合并发挥生物学活性的配体。VDR可分为膜受体(mVDR)和核受体(nVDR)两大类，mVDR主要参与钙磷平衡的维持，而nVDR通过影响基因表达调控相应蛋白质的合成。VDR基因具有高度多态性，目前报道有22个点突变均可导致VDR基因功能缺失，已经证实VDR基因多态性多种疾病相关，如多发性硬化、类风湿关节炎、乳腺癌、糖尿病、恶性黑色素瘤、银屑病、骨质疏松等b8|，目前研究最多的有FokI、BsmI、Apal、和TagI4个限制性酶切位点，分别位于第2外显子、第8内含子、第8内含子和第9外显子，一般用f，b，a，t表示存在这4种内切酶的多态性位点，用F，B，A，T表示缺乏这4种内切酶多态性位点。其他的还有第8内含子Tru9I以及在3’端下游区域的poly—A多态性口9。。研究发现VDR基因的多态性并不改变VDR蛋白的氨基酸序列，而影响VDR基因的转录。全基因组扫描已发现VDR是与哮喘相关联的候选基因。FokI位点多态性最早被Orton等H叨在双胎MS研究中报道，近年来在其他疾病中被广泛研究。rs2228570(FokI)位于VDR的编码区域(第2外显子)，是唯一能影响VDR编码氨基酸的多态位点，目前很多实验证明FokI位点是由于427ATG—ACG突变，其多态性的存在使VDR基因第2外显子上有两个潜在的起始转录点，即使VDR翻译从第2个密码子开始，从而导致翻译出的蛋白质比正常VDR基因编码少了3个氨基酸，为424个氨基酸，但424aa的转录活性大大增强[41-42]。rs7975232(ApaI)和rsl544410(BsmI)都位于VDR基因第8个内含子，rs7975232由于G—T突变，rsl544410则由于G—A突变，这两个位点位于非编码区，其多态性虽不影响VDR的氨基酸序列，但蛋白质的合成受mRNA37末端非翻译区的调控，rsl544410和rs7975232的多态位点正位于该区域，其碱基的改变影响了mRNA的稳定性，从而影响了VDR的表达(可能通过影响受体的数量，增强子对靶位的亲和力或与维生素D的亲和力)；rs757343(Tru9I)位点也位于VDR基因第8个内含子，其发生G—A突变，是2000年由法国Ye等H33首先发现并报道，Zajickova等m12003年再次证明了此位点的存在。rs731236(TaqI)多态位点则是位于VDR的3’端第9外显子上，327ATT—ATC突变，其多态性是由无义突变造成的，虽不会使VDR的氨基酸序列改变，可能会导致 硕士学位论文mRNA的稳定性及转录效率的改变，亦会影响到VDR的表达。许多涉及维生素D受体多态性与哮喘的关联研究，结果并不一致。PoonAH等的两项在北美家庭中对VDR基因多态位点与哮喘的研究中发现具有相关性[45-46]；在国内，针对VDR基因常见的多态位点的研究，Aaadi等H73对VDR基因rsl544410(BsmI)、rs2228570(FokI)、rs731236(TaqI)与哮喘的研究中未发现具有相关性；Fang等n1对VDR基因rsl544410(BsmI)、rs2228570(FokI)与哮喘的关联研究中未发现具有统计学意义；Li等H踟对VDR基因rs2228570(FokI)与哮喘的研究也未有阳性发现；最近一项来自法国224个家庭的951个哮喘儿童的研究，虽然在VDR基因中发现了13种单核苷酸多态性(包括FokI、BsmI、TaqI)，但是其与哮喘发生之间的联系却不具有统计学意义H9。；而一项对突尼斯儿童VDR基因的多态性研究发现，rs2228570(FokI)的基因型“FF”、rsl544410(BsmI)等位基因“B”、rs731236(TaqI)基因型“TT、Tt”在哮喘组与正常对照组相比差异有统计学意义，携带等位基因“F、B、T”的儿童发展为哮喘的危险系数分别是正常儿童的1．57、2．15、2．33倍，而对于rs7975232(ApaI)未发现其与哮喘有相关，该研究还发现BsmI—ApaI—TaqI存在强烈的连锁不平衡，但这四个多态位点与哮喘的严重程度无统计学意义陆0|。BsmI、ApaI、Tru9I虽位于内含子区域，TaqI其突变也为无义突变，但多个研究表明畸H3IBsmI、ApaI、TaqI、Tru9I这四个位点存在着连锁不平衡，尤其是BsmI和TaqI之间。BsmI还与位于3’非翻译区的poly(A)存在强烈连锁Is4]，由于3’非翻译区可以影响mRNA的表达和稳定性瞄5I，其连锁不平衡的存在可能会改变VDR基因的翻译效率，改变VDR蛋白的表达，从而改变了哮喘患儿的表型。本研究对VDR基因相关多态性位点进行直接正向测序，结果更准确可靠，有利于发现新的遗传变异。本实验在哮喘组和对照组内分别均检测到rs2228570(FokI)三种基因型TT、TC、CC，在哮喘组的分布分别是：17．5％、35％、47．5％，在对照组的分布分别是22．5％、40％、37．5％，差异无统计学意义(x2=0．854，P=O．652)，其等位基因T、C在两组的分布也无统计学意义(x2=0．948，P=O．330)，3S 讨论对哮喘的风险进行分析后未发现等位基因“T、C’’增加了发生哮喘的风险，提示着这个多态性位点可能与发生哮喘无关联；在两组中对于rs7975232(ApaI)、rsl544410(BsmI)、rs731236(TaqI)这三个多态位点分别只检测到野生型和杂合型两种基因型的存在，分别是：GG、GT；GG、GA；TT、TC，在两组的分布频率有统计学差异，对哮喘的风险进行分析后发现：基因型GG、GA、TT可能增加了发生哮喘的风险[OR分别是1．923、2．091、2．00，95％C1分别是(1．158-3．193)、(1．183-3．695)、(1．212—3．301)]，携带等位基因“G、A、T’’的儿童发展为哮喘的危险系数分别是正常儿童的1．226、2．091、1．245倍，而在rs7975232(ApaI)和rs731236(TaqI)这两个位点中，突变的“GT、TC”可能为哮喘的保护因素；在本研究中还发现了另一个多态位点rsl1574114，目前关于该位点报告不多，曾在MS、肺结核中研究过，基因型为GG、GC、CC，其在两组的分布差异有统计学意义(X2=7．632，P=O．022)，携带C等位基因可能增加了发生哮喘的机会[ORl．952，95％CI1．276—2．986)]；对于rs757343(Tru9I)位点，本研究在两组儿童中均检测到三种基因型GG、GA、AA的存在，在哮喘组的分布分别是：30％、37．5％、32．5％，在对照组的分布分别是57．5％、27．5％、15％，差异有统计学意义(X2=6．651，P=O．036)，其等位基因T、C在两组的分布有统计学意义(x2=8．438，P=O．004)，对哮喘的风险进行分析后发现：等位基因A可能增加了发生哮喘的风险[OR分别是1．783，95％C1分别是(1．188—2．675)]，提示rs7975232、rsl544410、rs731236、rsll574114、rs757343多态性的存在可能影响了哮喘的易感性和相关表型。我们从本实验的结果推测VDR基因的突变可能影响了VDRmRNA的表达和稳定性，改变了VDR基因的翻译效率，影响了VDR蛋白的表达，从而促成哮喘的发生。由于哮喘是一种复杂性疾病，其发病是由多个基因的相互作用以及环境共同引起。因此，基因一基因的相互作用，基因一环境的相互作用都可能影响实验结果，而且基因候选法所发现的易感基因相关性并非每一个都能被重复证实，原因可能为基因的异质性及环境等因素的不同，且不同人群中SNP的分布频率不同，因此造成各个实验结果的差异。我们对哮喘易感基因研究的最终目的是为了能从基因水平筛选哮喘易感人群，早期诊断，36 硕士学位论文早期干预。相信维生素D受体基因的进一步研究能为哮喘易感性筛查提供新的遗传学标记，也能为哮喘基因治疗及药物的研发提供新的理论依据。37 讨论结论本课题采用酶联免疫吸附实验、PCR扩增、基因测序等技术研究了血清25一(OH)-VD、IL一4、IL-5、IFN-Y在哮喘发病中的作用以及VDR基因多态性与儿童哮喘的相关性。通过研究我们得到以下结论：1、哮喘患儿血清25-(OH)-VD浓度降低，提示我们哮喘患儿可能存在血清25-(OH)一VD不足或缺乏，血清25-(OH)一VD可能在哮喘发病中发挥作用。2、VDR基因多态位点rs7975232、rsl544410、rs731236、rsll574114、rs757343基因型及等位基因分布在两组间存在差异，其多态性可能与哮喘发病相关；VDR多态位点rs2228570基因型分布在两组间不存在差异，其多态性可能与哮喘不相关。3、哮喘患儿血清中IL-4、IL-5表达升高，IFN-Y分泌下降，提示我们哮喘患儿可能存在T细胞亚群细胞因子失衡，即Thl细胞功能不足及Th2细胞功能亢进，Thl／Th2失衡可能在哮喘发病中发挥作用。 硕士学位论文不足与展望1、样本量偏小，进一步研究需加大样本量。2、本研究未对VDR多个多态位点组成的单倍型进行分析，进一步研究可展开这方面研究。39 参考文献【2】．[3】．[4】．[5】．【6】．[7】．【8】．【9】．【10]．【12]．[131．SaadiA，GaoGLiH，WeiC，GongYLiuQ．AssociationstudybetweenvitaminDreceptorgenepolymorphismsandasthmaintheChineseHanpopulation：acase-controlstudy．BMCMedGenet2009；21(10)：71．徐金瑞，纳小菲，杨易，宁夏汉族人群VDR基因4个SNPS位点基因多态性与2型糖尿病的关联性分析，吉林大学学报，2012，38(5)：985．989．柏娟，赵京，申昆玲等，北京、重庆、广州三城市儿童哮喘患病情况调查，中华临床免疫和变态反应杂志，2010，4(4)：280．285．BaekeF，TakiishiT，KorfH．VitaminDmodulatoroftheimmunesystemJ．CurrOpininPharmacol2010，10(4)482．496．HiemstraPS．Theroleofepithelialbeta-defensinsandcathelicidinsinhostdefenseofthelung．ExpLungRes2007；33：537—542．GuillotX，SemeranoL，Saldenherg-Kermanac’hN．VitaminDandinflammation【J】．JointBoneSpine2010，77(6)：552--557．WhiteJI-I．VitaminDasaninducerofcathelicidinantimicrobialpeptideexpression：past，presentandfuture[J]．JSteroidBiochemMolBiol，2010，12l(1-2)：23年之38．PedersenAW，ClaessonMH，ZoccaMB，eta1．DendriticcellsmodifiedbyVitaminD：futureimmunotherapyforautoimmunediseases．VitamHorm，2011，86：63—82．PennaG，AdofiniL．1Alpha25一dihydroxyvitaminD3inhibitsdifferentiationmaturationactivationandsurvivalofdendriticcellsleadingtoimpairedalloreactiveTcellactivation[J]．JImmunol2000，164(5)：2405--2411．UrryZ，XystrakisE，RichardsDF,eta1．LigationofTLR9inducedonhumanIL-10secretingTregsby1,25-dihydroxyvitaminD3abrogatesregulatoryfunction【J】．ClinInvest,2009，119：387-398．XystrakisE，KusumakarS，BesweHS，eta1．ReversingthedefectiveinductionofIL-10‘secretingregulatoryTcellsinglucocorticoid—resistantflsthmpatients．JClinInvest，2006，l16：146．155．WuZ，MacPheeIA，OliveiraDB．ReactiveoxygenspeciesintheinitiationofIL一4drivenautoimmunityasapotentialtherapeutictarget．CurrPharmDes．2004；10(8)：899-913．MenziesGowA，RobinsonDS．Eosinophils，eosinophiliccytokines(interleukin-5)，and 硕士学位论文[14]．[15]．[16]．[17]．[18】．[19]．【201．【21]．【221．【23】．[241．【25]．【26]．【27]．antieosinophilictherapyinasthma[J】．CurrOpinPulmMed，2002；8：33—8．赵宏霞，庄哈娜，柯宇星，等支气管哮喘患儿血清白细胞介素．4、白细胞介素．5和C干扰素水平检测的意义[J]．实用儿科临床杂志，2011,26(4)：270．271CorrenJ．Inhibitionofinterleukin-5forthetreatmentofeosinophilicdiseases[J]．DiscovMed，2012，13(71)：305-12．Haldar,P．eta1．Mepolizumabandexacerbationsofrefractoryeosinophilicasthma．N．En91．J．Med．2009，360：973-984Naireta1．Mepolizumabforprednisone-dependentasthmawithsputumeosinophilia．N．En91．J．Med．2009，360：985-993李飞，高金明．维生素D、维生素D受体与支气管哮喘中华哮喘杂志(电子版)，2010，4(1)：38—42．TopilskiI，FlaishonL，NavehYHarmelinA，LevoYShacharI．Theanti-inflammatoryeffectsof1,25-dihydroxyvitaminD3onTh2cellsinvivoaredueinparttothecontrolofintegrin-mediatedTlymphocytehoming．Eur．J．Immun01．2004．34：1068·1076．MahonBD，WittkeA，WeaverVeta1．ThetargetsofvitaminDdependonthedifferentiationandactivationstatusofCD4positiveTcells[J]．JCellBiochem2003；89(5)：922—932．NasholdFE，HoagKA，GovermanJ，etal．Rag212dependentcellSal'enecessaryfor1，25-dihydroxyvitaminD3preventionofexpermientalauto2mimuneencephalomyelitis[J]．JNeuromimunol2001，119(1)：16·29．MattnerF，SmiroldoS，GalbiatiF，eta1．InhibitionofThldevelop2mentandtreatmentofchronic-relapsingexpermientalallergicencephal02myelitisbyanon2ypercalcemicanalogueofl，25一dihydroxyvitaminD3[J]．Eur．J．Immunol，2000，30(2)：498—508．CamargoCAJr,InghamT,WickensK，eta1．Cord-blood25-hydroxyvitaminDlevelsandriskofrespiratoryinfection,wheezing，andasthma．Pediatrics201l；127：e180一e187．UrashimaM，SegawaLOkazakiM，eta1．RandomizedtrialofvitaminDsupplementationtopreventseasonalinfluenzaAinschoolchildren．AmJClinNutr2010；91：1255—1260．ChinellatoI，PiazzaM，SandriM，PeroniD，PiacentiniGBonerAL．VitaminDserumlevelsandmarkersofasthmacontrolinItalianchildren．JPediatr201I；158：437-441．ChinellatoI，PiazzaM，SandriM，PeroniDGCardinaleF，PiacentiniGLeta1．Vita-minDserumlevelsandexercise．inducedbronchoconstrictioninchildrenwithasthma．EurRespirJ2010；37：1366-1370．ZoskyGRBerryLJ，ElliotJGJamesAL，GormanS，HartPH．VitaminDdeficiencycausesdeficitsinlungfunctionandalterslungstructure．AmJRespirCritCareMed201I：183：1336-1343．41 参考文献[28]．[291．[30]．【31】．[32]．[331．【34]．[35]．【36]．【37]．[38]．[39]．【40]．【411．Bosse、YMaghniK，HudsonTJ．1alpha,25-dihydroxy-vitaminD3stimulationofbron·chialsmoothmusclecellsinducesautocrine，contractility,andremodelingprocesses．PhysiolGenomics2007；29：161——168．SongY,WuC，QiH．Effectof1,25(OH)2D3(avitaminDanalogue)onpassivelysensitizedhumanairwaysmoothmusclecells[J]．Respirology,2007，12(4)：486-494．AriueB，AlbanRF．PAI·1promotesextracellularmatrixdepositionintheairwaysofamurineasthmamodel[J]．BiochemBiophysResCommun，2002，294(5)：1155-l160．CharokoposN，ApostolopoulosN，KalapodiM，eta1．Bronchialasthma,chronicobstructivepulmonarydiseaseandNFkappaB．CurtMedChem，2009，16：867-883．SandhuMS，CasaleTB．TheroleofvitaminDinasthma[J]．AnnAllergyAsthmaImmunol，2010，9(3)：105-133．GagliardoR,ChanezP，MathieuM，eta1．PersistentactivationofnuclearfactorkappaBsignalingpathwayinsevereuncontrolledasthma．AmJRespirCritCareMed，2003，168：1190．1198．陈凌燕，周小建，李霞，等孕期哺乳期大鼠补充维生素D3对子代大鼠哮喘模型肺组织维生素D受体表达的影响临床儿科杂志，2012，30(5)：470-473．MiyakeYSasakiSTanakaK．DairyfoodcalciumandvitaminDintakeinpregnancyandwheezeandeczemaininfantsI-J1．EurRespirJ．2010，35(6)1228-1234．FanL，TuX，ZhuKZhouL，Pfeiffer￡FeltensRStoecker彤ZhongR．GeneticassociationofvitaminDreceptorpolymorphismswithautoimmunehepatitisandprimarybiliarycirrhosisintheChinese．JGastroenterolHepatol2005，20：249-255VanEttenE，MathieuC．Immunoregulationby1,25一dihydroxyvitaminD3：basicconcepts．JSteroidBiochemMolBiol2005，97：93-101．RuceviI，BarisiD，ruskoV，GlavasObrovacL，eta1．VitaminDendocrinesystemandpsoriasisvulgarisreviewoftheliterature[J]．ActaDermatovenerolCroat2009．17：187．192．JunSun．VitaminDandmucosalimmunefunctionEJ]．CurtOpinGastroenterol，2010，26(6)：591-595．．OrtonSM，MorrisAP，HerreraBM，RamagopalanSV，LincolnMRChaoMJ，eta1．EvidenceforgeneticregulationofvitaminDstatusintwinswithmultiplesclerosisl-J]．AmJClinNutr,2008．88(2)：441—447．AraiH，MiyamotoK，TaketaniYYamamotoH，IemoriYMoritaK，eta1．AvitaminDreceptorgenepolymorphisminthetranslationinitiationcodon：effect00proteinactivityand42 硕士学位论文[42]．【431．【44]．[45]．【46]．【47]．【48]．【49]．[50]．【5l】．[52]．[53]．【54]．relationtobonemineraldensityinJapanesewomen．JBoneMinerRes1997；12：915-921．WhitfieldGK，RemusLS，JurutkaPW,ZitzerH，OzaAK，DangHT,eta1．FunctionallyrelevantpolymorphismsinthehumannuclearvitaminDreceptorgene．MolCellEndocrinol2001；177(1—2)：145--159．YeWZ，ReisAF，VelhoG．IdentificationofanovelTnl91polymorphisminthehumanvitaminDreceptorgene．JHumGeneL2000，45：56-57．ZajickovaK，KrepelovaA，ZofkovaI．ASinglenueleotidepolymorphismunderthereverseprimerbindingsitemayleadtoBsmIMis-GenotypingintheVitaminDreceptor．JBoneMinerRes，2003，18：1754-l757．PoonAH，LapfiseC，LemireM，MontpetitA，SinnerD，SchurrE，eta1．AssociationofvitaminDreceptorgeneticvariantswithsusceptibilitytoasthmaandatopy．AmJRespirCritCareMed2004；l70(9)：967-973．，RabyBA，LazarusRSilvermanEK，LakeS，LangeC，WjstM，eta1．AssociationofvitaminDreceptorgenepolymorphismswithchildhoodandadultasthma．AmJRespirCritCareMed2004；170(10)：1057-1065．LiF，JiangL，Willis—OwenSA，ZhangYGaoJ．VitaminDbindingproteinvariantsassociatewithasthmaSUSCeptibilityintheChineseHanpopulation．BMCMedGenet2011；12：103．FangWL，GaoLB，LiangWB，XueH，BaiELvML，eta1．AssociationanalysisofvitaminDreceptorgenepolymorphismsinChinesepopulationwithasthma．IranJAllergyAsthmaImmunol2009；8(3)：141—147．WjstM．VariantsinthevitaminDreceptorgeneandasthma．BMCGenet2005；15(6)：2．HaifaM，Fay9alHS，AnissaB，eta1．AssociationofvitaminDreceptorgenepolymorphismswithsusceptibilitytoasthmainTunisianchildren：Acasecontrolstudy．HumanImmunology2013，74：234-240．SearingDA，ZhangY,MurphyJR，HaukPJ，GolevaE，LeungDY．DecreasedserumvitaminDlevelsinchildrenwithasthmaareassociatedwithincreasedcorticosteroiduse．JAllergyClinImmunol2010；125：995一1000．HayesCE，NasholdFE，SpachKM，PedersenLB．TheimmunologicalfunctionsofthevitaminDendocrinesystem．CellMolBiol2003；49：277-300．FluggeJ,KrusekopfS,GoldammerM，eta1．VitaminDreceptorhaplotypcsprotectagainstdevelopmentofcolorectalcancer．EarJClinPharmac01．2007．63：997-1005．InglesSA，HaileRW，HendersonBE，eta1．StrengthoflinkagedisequilibriumbetweentwovitaminDreceptormarkersinfiveethnicgroups：implicatiousforassociationtudies．Cancer43 参考文献EpidemiolBiomarkersPrey，1997，6：93-98．【55]．UitterlindenAG，FangY，VanMcurJB，eta1．GeneticsandbiologyofvitaminDreceptorpolymorphisms．Gene，2004，338：143·156． 硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称IBDinflammatoryboweldisease炎症性肠病MSMultipleSclerosis多发性硬化T1DMType1DiabetesMellitusI型糖尿病DCsDentriticCells树突状细胞TregsregulatoryTcellsD朔Ovalbumin调节性T细胞SNPssinglenucleotidepolymorphisms鸡卵白蛋白nVDRnuclervitaminDreceptor单核苷酸多态性mVDRLinkagedisequilibrium连锁不平衡LDmembranevitaminDreceptor核受体FGF23fibroblastsproducefactorcytotoxic23膜受体VDRvitaminDreceptor成纤维细胞生成因子23TLI圆Toll-likereceptors9维生素D受体Toll样受体9GM．CSFgranulocytecolonystimulatingfactor粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子EDl’Aethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸MHCIIMajorhistocompatibilitycomplex-II主要组织相容性复合体一III呶retinoidXreceptor维甲酸X受体ECMExtracellularmatrix细胞外基质MMP．9matrixmetalloproteinase基质金属蛋白酶一9NF．r,Bnuclearfactor-r,B核转录因子KB45 成果发表论文陈晓锐，赵宏霞．儿童哮喘急性发作布地奈德+沙丁胺醇及甲泼尼龙疗效比较．武警医学，2014，25(3)：231—234．赵宏霞，陈晓锐．儿童血清25羟基维生素D水平及其受体基因多态性与哮喘的相关性．中国实验诊断学(已录用)． 硕士学位论文综述维生素D与儿童支气管哮喘综述：陈晓锐审校：赵宏霞【摘要】目前儿童支气管哮喘正呈增长趋势，已经成为严重危害儿童身心健康的慢性疾病。维生素D其作为一种第二类固醇激素，还具有强大的免疫调节作用，与固有和适应性免疫应答均有密切关系，并可能参与了儿童哮喘发病机制。流行病学研究也表明，哮喘儿童大多存在维生素D的不足或缺乏，补充维生素能改善哮喘儿童的临床状况，如若以此为突破口，将对哮喘的治疗产生重大的影响。本文将对血清维生素D水平与儿童哮喘的相关性及其可能机制做一综述。【关键词】支气管哮喘；儿童；25羟基维生素D3；维生素D受体近年来，过敏性疾病的发生在全世界不断增加，特别是哮喘，据预测，到2025年，全世界哮喘将达到4亿人，它已成为儿童时期常见的慢性气道炎性疾病n‘21。哮喘的确切发病机制至今虽未完全明确，但多种遗传和环境因素的协调作用在哮喘的发生发展中发挥着至关重要的作用。维生素D(VD)，这种过去一直被认为具有调节骨代谢和钙平衡的作用，而今越来越多的流行病学、遗传学和动物模型实验研究表明，其作为一种第二类固醇激素，还具有强大的免疫调节作用D‘43，与固有和适应性免疫应答均有密切关系∞1，并可能参与7"JL童哮喘发病机制，本文就维生素D的代谢及生理机能、对哮喘的流行病学研究和可能的发病机制作一番阐述。1维生素D的代谢及生理机能维生素D属于脂溶性维生素，主要包括VD2(麦角钙化醇)及VD3(胆钙化醇)，分别由吸收进入体内后储存在皮下的麦角固醇(存在植物中)和7一脱氢胆固醇(存在动物中)在紫外线290一--315nm照射下转变而来。它们随血液循环运输至肝脏，经肝微粒体25一羟化酶(基因型CYP2R1)作用转变为25一(0H)一VD，在肾脏24—47 综述羟化酶(基因型CYP24A1)作用下转化为VD3的活化形式1，25一(oH)一VD。维生素D的作用主要是调节钙磷代谢、促进骨骼生长、调节细胞生长及分化、促进适应性免疫、增强天然免疫、抗肿瘤、抗炎、减慢细胞周期、减少呼吸道重塑、增强糖皮质激素(GC)作用、克服GC抵制等作用№1。2维生素D对哮喘的流行病学研究对于体内VD的含量监测，一般推荐用血清25一(oH)一VD水平作为测定指标。目前公认的判断标准为：维生素D缺乏症指的是血清25一(0H)一VD水平<50mmol／L；维生素D相对不足指的是血清25一(oH)一VD水平为50—75mmol／L；血清25-(OH)-VD水平>75mmol／L定义为维生素D水平正常口1。Sharief随1等分析了美国2005—2006年的全国健康和营养调查，其中血清VD的水平缺乏(<15ng／m1)的患儿和VD充足的(>30ng／m1)患儿相比较，过敏原阳性率、Ig—E水平都更高。Brehm呻1等在哥斯达黎加地区对616例年龄在6-14岁的哮喘儿童的一项横断面研究中发现，血清维生素D水平与哮喘发病率、严重程度、住院率、抗炎药物使用、气道高反应性密切相关。LeeJS和ZhaoH等n町的研究表明血清VD水平能够提高哮喘或其他有过敏性疾病的患儿抵抗肺炎链球菌的能力。Searing⋯3等在北美100例哮喘儿童横截面研究中发现血清维生素D与肺功能呈正相关，与患儿的总IG-E、过敏程度、吸入或口服激素的使用之间有密切的联系，并能增强类固醇激素的效应。Camargon21等对新西兰922个新生儿的研究中发现脐带血中低水平的维生素D增加了他们三个月时患呼吸道疾病的机会。目前众多的流行病学、临床研究已表明血清维生素D降低会增加患儿哮喘的患病率，加重哮喘的发作，Chinellaton31等发现低水平的VD降低患儿的肺功能，它与肺容量(FVC)、第一秒用力肺活量(FEVI)呈正相关。目前也有研究表明生命早期给予补充VDn41可减少出生后患喘息性疾病的机会。Urashima口51等在一项随机、双盲、对照的临床试验中也显示：在流感季节给予哮喘患儿维生素D补充治疗降低了患儿患季节性流感A的机会，从而大大减少了诱发哮喘的可能。国内陈凌燕等n阳通过在大鼠孕期和哺乳期给予不同剂量维生素D干预，发现孕期及哺乳期补充适量维生素D可减少子代大鼠哮喘模型维生素D受体(VDR)的表达，减轻气道炎 硕士学位论文症反应，但过量补充维生素D则增加VDR表达，可能加重气道炎症反应。可见，VD缺乏和过量都可能使过敏性疾病增加，因而干预的剂量十分重要，对于维生素D补充治疗，如何补的问题，包括补充的剂量、持续的时间等问题，目前国内外研究还不是很多，大多是一些小样本研究，或持续的时间太短n7。1引，导致得出的结论还不确切，因此仍需进一步大样本的临床研究明确。3维生素D与哮喘发病的相关性3．1维生素D与机体免疫人体免疫应答可分为固有免疫和适应性免疫应答，呼吸道上皮细胞、肺泡巨噬细胞、树突状细胞等参与固有免疫，T细胞、B细胞参与获得性免疫。维生素D被认为在这两种免疫中发挥重要的作用n蚴1。支气管上皮细胞作为气道内外环境的第一道屏障，其在哮喘的发生发展过程中具有重要作用，研究乜11发现其上皮细胞具有羟化25维生素D，使其转化为有活性的1，25一(OH)-VD，它主要是通过募集巨噬细胞，促进其分化，增加抗菌肽LL一37的表达瞳引，使宿主对结核杆菌、其他一些细菌、真菌、病毒具有抵抗能力乜3‘25|，而肺泡巨噬细胞则识别、吞噬、清除抗原防271，在机体固有免疫方面发挥重要的作用；1，25-(OH)-VD对T细胞具有调节作用，其中CD4+T细胞是1，25一(oH)一VD作用的直接靶点。CD4+T细胞在功能上可分为Thl和Th2，1，25一(oH)一VD能调控Th]／Th2免疫偏移乜引，哮喘的发生主要由于Thl／Th2的失衡所致，Th2细胞功能亢进是其基础。目前多项研究表明维生素D有抑带lJThl淋巴细胞和增强Th2淋巴细胞功能的作用，考虑维生素D水平可能通过此途径影响哮喘的发生∞3。3．3维生素D与肺功能支气管平滑肌在气道重建、管腔缩窄、支气管收缩中具有重要的作用，有研究啪1发现维生素D能抑制支气管平滑肌的增生，影响气道的重塑和肺功能。国内栾斌b¨等的动物实验结果也表明l，25一(OH)一VD不仅能有效缓解哮喘的发作程度，还可下调哮喘小鼠肺内巨噬细胞、树突状细胞(DC)上T细胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白(TIM4)mRNA的表达，改变TIM4蛋白的表达量，从而降低气道炎症、改善气道重塑和肺功能。3．2维生素D与哮喘相关细胞因子维生素D主要是通过多种免疫细胞如肥大细胞、树突状细胞(DCs)、调节型T细胞(Tregs)等及其分泌的细胞因子的相互49 综述作用在哮喘的发病机制中发挥着重要的免疫调节作用。DCs被认为是机体内T淋巴细胞性免疫反应的始动因素，1，25一(OH)一VD通过影响DC分化、成熟和共刺激分子表达诱导免疫抑制。有研究发现，1，25一(OH)一VD及其类似物可以抑$1]OCs的成熟和分化，被1，25-(OH)-VD及其类似物作用的DCs抑制细胞协同刺激分子CD40和CD80／CD86表达，降低IL-12合成，增加了IL-IO的合成，从而降低T细胞活化，导致调节性T细胞的无反应性或特异性免疫耐受甚至诱导细胞进入凋亡。VD还能够诱导Treg细胞的分化，Urry等口21研究发现在地塞米松和VitD，的共同刺激诱导CD4+Tregs细胞可以分泌高水平的IL一10，提示Tregs细胞能参与抑制过敏和哮喘疾病发病机制中的免疫反应能力。而且过敏原的刺激后分泌TL一10的Treg细胞以一种IL-IO依赖的方式抑制抗原诱导的Th2分泌的细胞因子，IL—10已被证明是一种重要的抗炎细胞因子，它可以抑制IFN—Y、IL一2、IL一5的生成，目前以IL一10为靶向治疗慢性气道炎症(如哮喘和慢性阻塞性肺气肿)方面的研究正在进行中。3．3维生素D受体(VDR)基因多态性自1994年Morrison首次报道VDR基因多态性与骨密度的关系以来，对VDR基因多态性与糖尿病、结核、骨代谢、生长发育相关性的研究陆续有报告。哮喘是一种复杂的由环境和遗传共同作用的疾病口1，VDR于1988年被克隆出来，定位于12q12一q14，长度为60—70kb，包括9个编码的外显子，共编码427个氨基酸，被发现在气道上皮均有表达，有多项研究显示VDR基因是观察哮喘基因非常好的候选者口31，其多态性也越来越受大家的关注。可能是因为VDR与l，25-(OH)一VD激素信号分子在靶细胞结合形成激素一受体复合物，该复合物作用于靶基因上的特定DNA序列，从而对结构基因的表达产生调节作用，影响了l，25-(OH)-VD的活性，影响了机体的免疫调节功能，由此可能诱发或加重某些疾病。VDR基因具有高度多态性，目前报道有22个点突变均可导致VDR基因功能缺失，常见的单核苷酸多态性位点(SNP)有FokI(rs2228570)、BsmI(rsl544410)、Tru9I(rs757343)、ApaI(rs7975232)和TaqI(rs731236)5个位点，分别位于第2外显子、第8内含子和第9外显子，及在3’端下游区域的50 硕士学位论文poly—A多态性。许多涉及维生素D受体多态性与哮喘的关联研究，结果存在着差异。PoonAH等的两项在北美家庭中对VDR基因多态位点与哮喘的研究中发现具有相关性口4。3引；Pillai口们等发现哮喘组儿童VDR基因型分布与正常对照组儿童基因型分布差异有统计学意义，VDR的变异与夜间哮喘发病率、肺活量的降低、皮肤点刺试验阳性率、Ig-E升高密切相关。一项来自法国D71224个家庭针对951个哮喘儿童的研究中，虽然在VDR基因中发现了13种单核苷酸多态性，但是其与哮喘发生之间的联系却不具有显著性差异；另一项在突尼斯哮喘儿童针对VDR基因的多态性研究发现，FokI、BsmI、TaqI在哮喘组与正常对照组相比差异有统计学意义，VDR基因的多态性可能增加了发生哮喘的机会口引。由于哮喘是一种复杂性疾病，其发病是由多个基因的相互影响以及环境作用共同引起，且不同人群中SNP的分布频率不同，因此各个实验结果可能会存在一定的差异。4讨论综上所述，VD、VDR在维持免疫系统平衡方面起重要作用，VD能诱导调节型T细胞分化，而VD及其下游的信号通路分子、调节型T细胞、相关细胞因子等形成网络共同维持免疫系统平衡。VD一旦缺乏，Thl／Th2之间的平衡被打破，易导致哮喘等过敏性疾病出现。因而在哮喘患儿中监测血清维生素D水平非常有意义，它可能可以作为预测哮喘严重度的指标，而补充维生素D水平后继续监测血清维生素D水平可能可以作为判断是否对哮喘治疗有效的标准之一。VDR基因是观察哮喘基因非常好的候选者，具有高度多态性，对其基因多态性的研究有利于从基因水平筛选哮喘易感人群，早期诊断，早期干预，并进行更有效的基因治疗；并可能为哮喘易感性筛查提供新的遗传学标记，为哮喘基因治疗及药物的研发提供新的理论依据。参考文献【1】．(CDC)CfDCaP．Vitalsigns：asthmaprevalence，diseasecharacteristics，andself-managementeducation：UnitedStates，2001-2009．MorbMortalWklyRep2011；60：547-552．[21．MoormanJE，ZahranH，TrumanBI，MollaMT．Currentasthmaprevalence：UnitedStates，51 综述【3】．[4】．[5】．【6】．【7】．[8】．【9】．[10]．【12]．【131．【141．【15]．【16]．[171．2006-2008．MMWRSurveillSumm201l；60(Suppl17)：84-86．HewisonM．VitaminDandinnateandadaptiveimmunity[J]．VitamHorm，2011,86：2362BikleDD．VitaminDinregulationofimmunefunction[J]．VitamHorm，2011,86：121HiemstraPS．Theroleofepithelialbeta-defensinsandcathelicidinsinhostdefenseofthelung．ExpLungRes2007；33：537-542．IqbalSF．FreishtatRJ．MechanismofactionofvitaminDintheasthmaticlung[J]．JInvestigMed，2011,59(8)：1200-1202．HolickMF．VitaminDdeficiency[J]．NEnglJMed，2007，357(3)：266--281．Sh撕efS，JariwalaS，KumarJ，eta1．VitaminDlevelsandfo·odandenviron-mentalallergiesintheUnitedStates：resultsfromtheNationalHealthandNutritionExaminationSurvey2005-2006[J]．AllergyClinImmunol2011；127：1195-1202．BrehmJM，CeledonJC，Soto-QuirosME，Avila’L，HunninghakeGM，FomoE，LaskeyD，SylviaJS，HollisBW：WeissST,eta1．SerumvitaminDlevelsandmarkersofseverityofchildhoodasthmainCostaRica．AmJRespirCritCareMed2009；179：765-771．LeeJs，ZhaoH，FentaY,KitaH，KumarR,JuhnYJ，Serum25-hydroxyvitaminDisassociatedwithenhancedpneumococcalantibodylevelsinindividualswithasthmaAllergyAsthmaProc，201l，32(6)：445-452，SearingDA，ZhangYMurphyJR，HaukPJ，GolevaE，LeungDY．DecreasedserumvitaminDlevelsinchildrenwithasthmaareas．sociatedwithincreasedcorticosteroiduse．JAllergyClinImmunol2010：125：995一1000．CamargoCAJr,InghamT,WickensK，eta1．Cord-blood25-hydroxyvitaminDlevelsandriskofrespiratoryinfection,wheezing，andasthma。Pediatrics2011；127：e180-e187。ChinellatoI，PiazzaM，SandriM，eta1．SerumvitaminDlevelsandexercise—inducedbronchoconstrictioninchildrenwithasthma．EurRespirJ201l；37：1366-1370．MiyakeYSasakiSTanakaK．DairyfoodcalciumandvitaminDintakeinpregnancyandwheezeandeczemaininfantsJ．EurRespirJ．2010，35(6)1228—1234．UrashimaM，SegawaT，OkazakiM，eta1．RandomizedtrialofvitaminDsupplementationtopreventseasonalinfluenzaAinschoolchildren．AmJClinNutr2010；91：1255．1260．陈凌燕，周小建，李霞，等孕期哺乳期大鼠补充维生素D3对子代大鼠哮喘模型肺组织维生素D受体表达的影响临床儿科杂志，2012，30(5)：470．473．Sidbury民SullivanAF,ThadhaniRI，CamargoCAJr．RandomizedcontrolledtrialofvitaminDsupplementationforwinter-related．atopicdermatitisinBoston：apilotstudy．BrJDermatol2008；159：245-247．52 硕士学位论文【18]．[191．[20]．[2l】．[22]．[23]．[24]．[25]．【26]．[27]．【28]．【29]．Majak只Olszowiec-ChlebnaM，SmejdaK，StelmachI．VitaminDsupple-mentationinchildrenmaypreventasthmaexacerbationtriggeredbyacuterespiratoryinfection．JAllergyClinImmunol201l；127：1294-1296．GindeAA，SutherlandER．VitaminDinasthma：panaceaortruepromise?JAllergyClinImmunol2010；126：59-60．LangeNE，LitonjuaA，HawrylowiczCM，WeissS．VitaminD，theim·manesystemandasthma．ExpertRevClinImmunol2009；5：693-702．HansdottirS，MonickMM，HindeSL，LovanN，LookDC，Hunning—hakeGW．RespiratoryepithelialcellsconveainactivevitaminDtoitsactiveform：potemialeffectsonhostdefense．JImmunol2008；181：7090-7099．HansdoairS，MonickMM，HindeSL，eta1．RespiratoryepithelialcellsconveainactivevitaminDtoitsactiveform：potentialeffectsonhostdefense[J]．JImmunol，2008，181(10)：7090-9．HansdottirS，MonickMM，LovanN，PowersL，GerkeA，HunninghakeGW．VitaminDdecreasesrespiratorysyncytialvirusinductionofNF·-kappaB··linkedchemokinesandcytokinesinairwayepitheliumwhilemaintainingtheantiviralstate．JImmunol2010；l84：965-974．HerrC，ShaykhievRBalsR．Theroleofcathelicidinanddefensinsinpul·monaryinflammatorydiseases．ExpertOpinBiolTher2007；7：1449-1461．LiuaT,StengerS，TangDH，ModlinRL．Cuttingedge：vitaminD-mediatedhumanantimicrobialactivityagainstMycobacteriumtuberculosisisdependentontheinductionofcathelicidin．JImmunol2007；179：2060-2063．HansdottirS，MonickMM，HindeSL，eta1．RespiratoryepithelialcellsconvertinactiveVitaminDtoitsactiveform：PotentiaIeffectsonhostdefense-JImmunol，2008，18l：7090-7099．HansdottirS，MonickMM，LovanN，PowersL，GerkeA，HunninghakeGW．VitaminDdecreasesrespiratorysyncytialvirusinductionofNF··kappaB·-linkedchemokinesandcytokinesinairwayepitheliumwhilemaintainingtheantiviralstate．JImmunol2010；184：965-974．胡雁，周善璧．1，25-二羟维生素D3的免疫调节机制及其应用【J】．国际眼科杂志，2008，28(2)：365-368．AndrBoonstra,BarratFJ，CrainC，eta1．1alpha,25·dihydroxyvitamind3hasadirecteffectonnaiveCD4+TcellstoenhancethedevelopmentofTh2cells【J】．JImmunol，2001，167(9)：4974-4980．53 综述[30]．【3l】．【32]．[33]．【34]．[35]．【36]．[37]．【38]．GuptaA，SjoukesA，RichardsD，eta1．RelationshipbetweenserumvitaminD，diseaseseverityandairwayremodelinginchildrenwithasthma．AmJRespirCritCareMed201l：184：1342-1349．栾斌，王亚哲，张艳丽，等l-25(OH)2D3对哮喘小鼠肺内TIM4表达的影响中国当代儿科杂志，2013；15(1)：67—70．UrryZ，XystrakisE，RichardsDF,eta1．LigationofTLR9inducedonhumanIL·10secretingTregsby1,25-dihydroxyvitaminD3abrogatesregulatoryfunction【J】．ClinInvest,2009，l19：387-398．BemdtA，SavageHS，SteamsTM，PaigenB．GeneticanalysisoflungfunctionininbredmicesuggestsvitaminDreceptorasacandidategene．MolGenetGenomics2011；286：237-246．PoonAH，LapriseC，LemireM，MontpetitA，SinnerD，SchurrE，eta1．AssociationofvitaminDreceptorgeneticvariantswithsusceptibilitytoasthmaandatopy．AmJRespirCritCareMed2004；170(9)：967-73．RabyBA，LazarusR，SilvermanEK，LakeS，LangeC，WjstM，eta1．AssociationofvitaminDreceptorgenepolymorphismswithchildhoodandadultasthma．AmJRespirCritCareMed2004；170(10)：1057-65．PillaiDK，IqbalSF,BentonAS，LernerJ，WilesA，FoersterM，eta1．AssociationsbetweengeneticvariantsinvitaminDmetabolismandasthmacharacteristicsinyoungAfricanAmericans：apilotstudy[J]．JInvestigMed2011；59(6)：938-46．wjstM．VariantsinthevitaminDreceptorgeneandasthma．BMCGenet2005；15(6)：2．HaifaM，Fay9alHS，AnissaB，eta1．AssociationofvitaminDreceptorgenepolymorphismswithsusceptibilitytoasthmainTunisianchildren：Acasecontrolstudy．HumanImmunology2013，74：234-240． 硕士学位论文致谢光阴荏苒，硕士研究生的学习即将结束，三年的学习生活使我受益匪浅。经历大半年时间的磨砺，硕士毕业论文终于完稿，回首大半年的收集标本、查文献、做实验、整理数据、思索、写作、修改直至最终的完成，我得到了许多的关怀和帮助，现在要向他们表达我最诚挚的谢意!首先，我要深深地感谢我的恩师赵宏霞主任，老师为人谦和，平易近人，乐观处事。老师在论文的选题、搜集资料和写作阶段，都倾注了极大的关怀和鼓励；在我初稿完成后，老师又在百忙之中抽出空来对我的论文认真的批改，字字句句把关，提出许多中肯的指导意见，使我在研究和写作过程中不致迷失方向，更上一层楼。她严谨的治学之风、对事业的孜孜追求、正直坚韧的品格将影响和激励我的一生，她对我的生活上的关心和教诲我更将永远铭记在心!借此机会，我谨向老师致以深深地谢意!其次，衷心感谢各位评委能在百忙之中抽出宝贵的时间参加我的论文评阅和答辩。还有衷心感谢武警医院领导及儿科科室领导安正红主任能给我这么宝贵的学习深造的机会!感谢中心实验室的谢建生主任、吴维箐主治医师、周璐医师在课题研究中给予的指导。感谢检验科朱岩主任、段纯主任、周方明医师对此次实验的悉心指导。感谢我的师姐庄哈娜、刘海英、刘瑜，师兄林伟斌，儿科科室吴春远、许美主治医师，我的同学蒋雪明、周彬婷、邱明慧、黄妙、陈丽媛以及儿科全体医护人员，在我的工作学习中给予的合作和无私的帮助。能在这样一个团队中度过，是我极大的荣幸!最后深深地感谢我的家人，感谢你们无私的付出和关照，才使我得以顺利完成三年的学习和工作。再次向大家表示诚挚的谢意155 学位论文原创性声明南方医科大学本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。除与外单位合作项目将予以明确方式规定外，本研究已发表与未发表成果的知识产权均归属南方医科大学。本人承诺承担本声明的法律效果。作者签名：社日～睨日期：2，·L中年F月I～日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南方医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于(请在以下相应方框内打“√”)：1、保密口，在一年解密后适用本授权书。2、不保密√作者签名：风n镗导师签名：日期：20(、f年岁月13日日期-)-oJ够年r月，口日56