补充3基因分析技术ppt培训课件

《补充3基因分析技术ppt培训课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、补充3基因分析技术从20世纪中期DNA双螺旋结构的阐明到20世纪末人类基因组序列图的绘制。为深入研究基因与基因组的结构与功能，特别是疾病基因和疾病相关基因的结构与功能的研究，提供了关键的技术和手段。因此，基因分析技术成为21世纪主导生物医学技术的核心技术之一利用基因分析技术可实现疾病的分子诊断，从DNA、RNA、蛋白质等生物分子水平上精确检测基因的序列、基因的表达与调控，探讨基因变异、基因表达差异与疾病发生发展的关系。近几年来令全球恐慌的SARS、禽流感等病原体基因结构和功能的快速揭示，正是应用了基因分析技术的结果。因此，可以预言基因分

2、析技术新方法的进一步发展和完善必将成为推动现代医学快速发展的主要动力第一节聚合酶链反应技术一、基本原理PCR技术是在模板DNA、引物和4种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应，类似于DNA的半保留复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物变性(denaturation)：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA离解，使之成为单链，以便其与引物结合退火(annealing)：温度突然降至37～58℃时，引物与变性的DNA单链(模板)在碱基互补的基础上形成引物-模板杂交双

3、链（由于反应体系中引物浓度远远大于模板DNA浓度，且引物结构简单，这极大地限制了变性后模板DNA单链之问的互补结合）延伸(extension)：在60～72℃时，TaqDNA聚合酶使引物从5′端向3′端按照碱基互补配对原则沿着DNA单链模板进行延伸，合成新的DNA互补链1.过程特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等2.优点3.PCR产物量计算①理论上PCR扩增效率应为100％，PCR产物随着循环的进行成指数形式增长[图16-2(a)]y=A2n（y为产物量；A为起始模板量；n为循环数）②实际上PCR扩增产物的指数增加形式并

4、不是无限制的。在PCR反应的后期，由于DNA聚合酶活性降低，模板拷贝数大量增加，引物及dNTPs量被大量消耗及模板互补链之间退火逐渐增加，PCR扩增效率下降，PCR产物的指数形式增长也逐渐变为线性增长直至出现平台(plateau)效应，即图16-2(b)为非指数形式增长y=A(1+R)n（R为扩增效率）计算PCR产物的量既要考虑到循环数，也要兼顾PCR扩增效率，在循环数和扩增效率已知的条件下，可通过y=A(1+R)n式估算PCR产物的量二、反应体系(一)PCR一般方案1.50μLPCR反应体系的组成(1)组成：①样品DNA0.1～1μg

5、；②正链引物(25μmo1/L)1.0μL；③负链引物(25μmo1/L)1.0μL；④脱氧苷三磷酸(dNTP各2.5mmo1/L；⑤10×PCR缓冲液50μL；⑥MgCl2(25mmo1/L)3.0μL；⑦TaqDNA聚合酶1～2.5U：⑧蒸馏的去离子水补至50μL。加入30μL液状石蜡，短暂离心混匀。(2)对照：阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏去离子水取代样品DNA2.PCR仪工作参数的设置94℃30～60s，55'C30～60s，72℃30～60s，循环30次，最后72℃延伸5min。(二)PCR的反应要素1．模板(t

6、emplate)即待扩增的目的基因或其特异性片段(靶序列)2．引物(primers)是人工合成的一对可以分别与两条模板DNA互补结合的寡核苷酸序列，合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析(HPLC)纯化。在PCR中，PCR扩增产物的大小是由特异引物限定的引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，增加引物二聚体的形成几率；浓度太低，则PCR扩增效率降低，甚至不能扩增。因此引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义设计原则(1)引物长度一般为15～30bp，常用的为20bp(2)分布的均衡性同一碱基连续出现不应超过5个，G

7、C含量一般为40％～60％(3)引物二聚体及一级结构引物二聚体是由于两个相同的或不同的引物分子之间存在较多的互补碱基而形成的(4)引物3′端延伸从引物的3′端开始，因此3′端的几个碱基与模板DNA均须严格配对，不能进行任何修饰(5)引物的特异性引物与非目的基因序列的同源性不超过70％(6)扩增区域的二级结构模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，往往难以充分变性。在选择引物时，应使扩增尽可能避开这些区域TaqDNA聚合酶具有良好的热稳定性；在92.5℃、95℃和97.5℃时，其半衰期分别为130min、40min和5～6min。Ta

8、qDNA聚合酶还具有良好的延伸效率，其生物学活性在75～80℃时最高，每一个酶蛋白分子每秒可延伸约150个核苷酸；往往70℃时，延伸效率为60个核苷酸／s以上。当温暖超过80℃时，该酶延伸速率明显下降，可能