7型腺病毒温州株基因组主要序列分析及感染性克隆的构建

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温州医学院硕士学位论文7型腺病毒温州株基因组主要序列分析及感染性克隆构建中文摘要目的：为研究7型腺病毒温州株(Ad7wzl)基因组主要序列及重组7型腺病毒(Ad7)载体的构建，分离得到Adwzl病毒株，克隆Ad7wzl基因组ITR(invertedterminalrepeats)、E1A261R、E1855kDa、Hexon和E3等主要序列并测序分析，构建Ad7感染性克隆，为进一步构建重组Ad7载体及应用于新型疫苗研究提供方法基础。方法：1、Ad的分离培养和基因组DNA提取、酶切鉴定以A549细胞分离培养痰液标本中的腺病毒。病毒纯化后提取基因组DNA进行BamHI、HindHI和Sinai的酶切分析。2、Ad7wzl基因组主要序列的克隆以提取的Ad7wzl基因组DNA为模板，PCR扩增Ad7wzlITR-L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3和ITR-R完整的基因，并将其克隆入pMDTM18．TSimpleVector中分别构建成重组质粒pMDl8Ts—ITR—L、pMDl8Ts—E1A261R、pMDl8Ts-E1855kDa、pMDl8Ts-Hexon、pMDl8Ts—E3和pMDl8Ts．ITR-R。通过限制性内切酶酶切和测序鉴定质粒构建是否正确。3、Ad7wzl基因组主要序列BLAST比对分析将测序后的六段基因序列于NCBI数据库进行BLAST比对。通过与GenBank已发表的各基因组进行相似度比较以确定该病毒株是否为Ad7。4、Ad7wzl基因组主要序列同源性分析经酶切鉴定正确后将各重组子送大连宝生物测序并与己在GenBank发表的五个Ad7基因组序列进行BLAST比对，并用BioEdit软件对Ad7wzlITR-L、E1A26lR、E1855kDa、Hexon、E3、ITR-R区的核苷酸及氨基酸序列进行同源性分析。5、穿梭载体pMDl8Ts-Adl-Adr的构建通过引入BamHI和EcoRI位点而改造了pMD'rM18一TSimpleVector。利用PCR的方法，以提取的Ad7wzl基因为模板，扩增Ad7wzl左右两端同源臂Adl和Adr完整的基因，并将其克隆入已改造的pMDTM18一TSimpleVector构建成穿梭载体pMDl8Ts-Adl-Adr。通过限制性内切酶酶切和测序鉴定质粒构建是否正确。2 温州医学院硕士学位论文6、Ad7感染性克隆pMDl8Ts-Ad7的构建及感染性鉴定穿梭载体pMDl8Ts-Adl．Adr经Pmel线性化后与Ad7wzlDNA共转化于感受态E．coliBJ5183中，氨卞霉素抗性平板筛选较小单菌落，挑取菌落培养并抽提质粒。限制性内切酶鉴定质粒构建是否正确。将构建好的感染性克隆pMDl8Ts-Ad7转染至A549细胞，观察是否病变以鉴定是否具有感染性。结果：l、Ad的分离培养和基因组DNA提取、酶切鉴定病毒基因组DNA的BamHI、H／ndIII和Sinai酶切图谱，对照国外文献，从BamHI的带型初步确定本次分离的Ad病毒株为Ad7d2型。2、Ad7wzl基因组主要序列T克隆的构建各重组质粒双酶切及ITR-L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3、ITR．R基因测序结果表明重组质粒pMDl8Ts-ITR-L、pMDl8Ts—E1A26lR、pMDl8Ts-E1855kDa、pMDl8Ts-Hexon、pMDl8Ts—E3和pMDl8Ts-ITR-R构建成功。3、Ad7wzl基因组主要序列BLAST比对分析BLAST比对结果显示本文得到的病毒基因组与HAd7有着最高的相似度，表明该病毒株为7型腺病毒。4、Ad7wzl基因组主要序列同源性分析序列分析及Bioedit软件比对结果表明其核苷酸序列和相应的氨基酸序列与GenBank已经发表的Ad7全基因组序列(AY495969、AY601634、AY594256、AY594255、BK005235)比较同源性分别达到93．0％100．O％和98．0％～100．O％。5、穿梭载体pMDl8Ts．Adl-Adr的构建。pMDl8Ts-Adl-Adr酶切及Adl和Adr基因测序结果表明pMDl8Ts-Adl-Adr穿梭载体构建成功。6、Ad7感染性克隆pMDTl8s-Ad7的构建及感染性鉴定pMDl8Ts-Ad7酶切、转染A549细胞产生CPE的结果表明Ad7感染性克隆pMDl8Ts-Ad7构建成功并具有稳定感染性。结论：本实验成功分离和鉴定了Adwzl病毒株，对Ad7wzl基因组主要序列进行了分析，并成功构建了Ad7感染性克隆pMDl8Ts-Ad7，为重组7型腺病毒载体的构建打下基础，并为进一步探讨Ad7感染性克隆在基因治疗及疫苗研究方面提供方法。关键词：7型腺病毒；序列分析；感染性克隆 温州医学院硕上学位论文AnalysisofAdenovimsType7WenzhouStrainGenomeMainSequenceandConstructionofInfectiousCloneobjgective：Toprovideddataandmaterialforthefuturestudyontheadenovirustype7wenzhoustrain(Ad7wzl)genomemainsequenceandconstructionoftheadenovirustype7(Ad7)vector,weisolatedtheAd7wzl，clonedandsequencedmainDNAfragmentsofAd7wzlincludingITR(invertedterminalrepeats)，E1A261R,E1855kDa,Hexon，E3EandSOon，constructedAd7infectiousclone．ThenlaythefoundationforthefurtherresearchaboutconstructingrecombinationAd7vectorandapplicatinginnewgenerationvaccine．Methods：1．IsolatedculturalofAdandextraction,identifiedthegenomeDNAIsolatedculturetheAdfromsputumbyA549cell．ExtractionthegenomeDNAafterpurificationofthe她thenidentifiedbyBamHI，HindlII，SmaI．2．ClonedAd7wzlgenomemiansequenceAmplifythefusiongeneAd7wzlITR-L，E1A261R，E1B55kDa，Hexon，E3andITR-RthroughPCRusingtheDNAwhichextractedfromA549culturecell．ThensubcloneitintopMD埘18-TSimpleVectortoconstructrecombinantplasmidpMDl8Ts—ITR-L，pMDl8Ts-E1A261R,pMDl8Ts-E1855kDa，pMD18Ts·Hexon，pMDl8Ts-E3andpMDl8Ts—ITR-R．Subsequentlydouble-enzymedigestedbyrestrictionenzymesandsequencedtocon_fh'mtheconstructionofthevector．3．BLASTofAd7wzlgenomemainsequenceBlastedthesixgeneinNCBIaftersequencing．SubsequentlycomparingtheidentitywithgenomewidesequenceofallvirusstrainswhichhavebeenreportedintheGenBanktoconfirmthevirusstrainwasAd7．4．AnalysedthehomologyofAd7wzlgenomemainsequenceAftersequencingtheserecombinants，Ad7wzlITR-L，E1A261R,E1855kDa,Hexon，E3andITR-Rwascomparied衍Ⅱ1genomewidesequenceoftheAd7strain(AY495969，AY601634，AY594256，AY594255，BK005235)whichhasbeenreportedintheGenBank．、5．ConstructedshuttlevectorpMDl8Ts-Adl—AdrRefompMDTM18一TSimpleVector4 温州医学院硕士学位论文byinductingintoBamHIandEcoRIsite．AmplifythehomologygeneAdlandAdrthroughPCRusingtheAd7wzlwhichisolatedculture．ThensubcloneitintopMDTM18-TSimpleVectortoconstructtheshuttlevectorpMDl8Ts-Adl-Adr．Subsequentlyerlzymedigestedbytherestrictionenzymesandsequencedtoconfirmtheconstructionofthevector．6．ComtructedandidentifiedAd7infectiousclonepMD18Ts-Ad7ShuttlevectorpMD18Ts—Adl-AdrwascotransformatedintoE．coliBJ5183withAd7wzlDNAafterlinearizedbyPmd，thenwescreenedsmallersinglebacterialcolonyfromAmpflatandextractedplasmid．Subsequentlyenzymedigestedbytherestrictionenzymestoconfirmtheconstructionofthevector,observingtheconditionofCPEaftertransfectingtoA549celllineswasappliedtoidentifytheinfectivity．1ksuits：1．IsolatedculturalofAdandextraction,identifiedthegenomeDNADigestedbytherestrictionenzymesBamHI，HindlII，Sinaiandcompared、Ⅳinltheliterature，theisolatedAdis入∞皿．2．ClonedAd7wzlgenomemiansequenceTheresultofdouble—enzymedigestionandsequencingindicatedthattherecombinationplasmidpMD18Ts—ITR-L,pMD18Ts-E1A261凡pMDl8Ts-E1855kDa，pMDl8Ts—Hexon，pMDl8Ts—E3andpMDl8Ts—ITR-Rwasidenticaltothedesign．3．BLASTofAd7wzlgenomemainsequenceTheresultofBLASTshowedthatAd7wzlhasthehighestidentity谢tllHAd7，SOitWasconfh'medasAd7．4．AnalysedthehomologyofAd7wzlgenomemainsequenceSequenceanalysisshowedthatthehomologyofthenucleotidesequencewas93．0％,--100．0％andthehomologyofthecommensurateaminoacidsequenceWas98．0％,-,100．0％aftercomparied谢mgenomewidesequerlceoftheAd7strain(AY495969，AY601634，AY594256，Ay594255，BK005235)whichhasbeenreportedintheGenBank．5．ConstructedshuttlevectorpMD18Ts-Adl-AdrTheresultofenzymedigestionandsequencingindicatedthattheshuttlevectorpMDl8Ts—Adl-Adrwasidenticaltothedesign．6．ConstructedandidentifiedAd7infectiousclonepMD18Ts—Ad7TheresultofenzymedigestionandthegenerationofCPEafterpMD18Ts-Ad7transfectingintoA5495 温州医学院硕士学位论文celllinesindicatedthattheinfectiousadenovirustype7clonepMDTl8s-Ad7wagidenticaltothedesign．Conclusion：WesuccessfullyisolatedtheAdwzlandanalysedAd7genomemainsequenceandconstructedAd7infectiousclonepMDTl8s-Ad7，thatwillestablishafoundationfortheconstructionofrecombinationAd7，andthenlaythemethodforthefurtherresearchaboutAd7infectiouscloneapplicatingingenetherapyandvaccine．Keywords：adenovimstype7；sequenceanalysis；infectiousclone6 温州医学院硕士学位论文7型腺病毒温州株基因组主要序列分析及感染性克隆构建．^』．—J一刖吾腺病毒(adcnovirus，Ad)是一种在人和动物中广泛分布的双链DNA，目前人类腺病毒家族分为A、B、C、D、E、F、G七组，已知基因序列的血清型约52种，其中7型腺病毒(adcnovirustypeseven，Ad7)属于B组【M】，现治疗常用的人2型及5型，血清学分类上均属C组。现在对腺病毒各方面的研究都进行得比较深入，其结构简单，在感染过程中可以产生大量的病毒砌妊，是研究真核基因表达调控机制的良好模型，宿主范围广泛，感染率高，易于培养和纯化，尤其是以腺病毒为载体构建重组活疫苗，表达重要的基因产物以及在癌症、遗传病和重要传染病的基因治疗等方面进行的研究最为热门。腺病毒基因组长约35kb，其两端各有一个反向末端重复区(invertedterminalrepeats，ITR)，ITR内侧为病毒包装信号。根据腺病毒DNA复制的起始时间，基因组分为早期转录基因(E)和晚期转录基因(L)[31。早期转录基因包括E1A、E1B、E2A、E2B(TP、pol、PIVaII)、E3(ADP等)和E4。晚期转录起始于主要晚期启动子(MLP)。早期基因E1(E1A、E1B)表达蛋白参与病毒基因和有关细胞基因的转录，是病毒基因活动的起始因子；E2(E2A、E2B)主要功能是调节和参与病毒DNA的复制；E3的基因表达产物与病毒逃避宿主免疫系统有关，为病毒复制的非必需区，缺少大部分或全部E3，病毒仍能在组织培养细胞上繁殖；E4参与病毒DNA的复制、晚期基因表达、转录子的拼接和宿主细胞生物合成终止等活动。而晚期基因主要编码结构蛋白，为装配成熟的毒粒所必需，因此基因结构较稳定【41。晚期转录区域有一个共同的三联先导序列(1PL)，由主要晚期启动子(MLP)所启动，转录产物为多顺反子，可长达20kb，通过不同的剪切加工，产生不同的mRNA，再翻译成不同的病毒蛋白。Ad7作为高效的基因运输载体必定与其特殊的基因结构与功能有关，因此，非常有必要研究其基因组结构，为构建新型腺病毒载体提供重要基础。从1978年Taniguchit5】首次获得动物病毒的感染性克隆以来，这种基于反向遗传学的研究方法越来越受到关注。感染性克隆就是指在细菌质粒中含有病毒全基因组DNA或者eDNA拷贝，使得eDNA本身或从eDNA体外转录所得的RNA具有感染性。感染性克隆技术也称拯救病毒，是克隆病毒基因组全长DNA或将病毒的基因组RNA逆转录成cDNA，对得到的eDNA进行修饰和改造，进行克隆后，利用体7 温州医学院硕士学位论文外转录技术或其他的方法，将cDNA拷贝转回到RNA状态，成为改造后的病毒基因组。利用感染性克隆可以在DNA水平上对病毒基因组进行改造，通过拯救病毒的表性变化来判断基因操作的效果，从而达到对病毒基因组表达调控机制，致病机理等进行研究的目的，甚至还可以发展新的病毒载体来表达外源基因以及进行疫苗的研制等奠定了理论基础【6】。Ad7感染性克隆的构建为重组7型腺病毒载体的构建打下基础。目前，构建重组腺病毒的方法主要包括体外连接法【7】、细胞内同源重组法【8】和细菌内同源重组法【9】。与前两种方法相比，细菌内同源重组法利用了细菌中高效的同源重组机制代替哺乳动物细胞，同时利用在同源重组时整合入病毒全基因组及外源基因，实现了同源重组与病毒包装过程相分离，重组病毒成功率高等优势。通过细菌内克隆全长的腺病毒基因组构建感染性克隆进而构建重组腺病毒载体是利用重组DNA技术使得人们能够在分子水平上对病毒基因组进行修饰与分析。从上世纪九十年代开始，腺病毒就作为了基因治疗的有效载体，已经报道的1000多种基因治疗的临床方案中，约26％是用腺病毒作为载体[10-11]。H1V重组腺病毒载体疫苗已在人体进行了免疫试验【眩l。美国默克实验室从1996年开始所开展的艾滋病疫苗研究工作绝大多数编码有潜在治疗作用的基因载体是用AdS构建的，这种疫苗的安全性已在动物和非人灵长类身上得到了成功的经验【13]。腺病毒载体可以在包装细胞内高滴度复制，是上呼吸道自然存在的温和病毒，可以感染多种分裂期和非分裂期的细胞。腺病毒感染机体后，再次注射会产生强烈的免疫反应，使得外源基因的表达会受到严重抑制，从而大大限制了腺病毒载体的反复使用【l¨51。此外，除B组外，其他腺病毒载体是通过柯萨奇病毒和腺病毒受体(CoxsackieandAdreceptor，CAR)来感染细胞，大量研究表明该病毒受体在原发性肿瘤表面的表达水平低下，严重影响基因转导效率，目前研究比较多的Ad2与AdS亦在此之列【l61。而据最新研究表明，Ad7与一种在干细胞及肿瘤细胞上广泛表达的未知受体结合ll匕研究证明，利用不同血清型腺病毒载体不仅可以解决免疫反应问题，也可解决受体的限制问题，因此7型腺病毒载体具有广泛的应用前景。Ad7做为口服活疫苗在美军新兵中使用，已有30多年的历史，由于它安全、可靠，并可在肠道里繁殖等特性，所以有着应用于基因治疗和制备活疫苗等领域的巨大潜力[17-18】。本文分两个部分阐述本课题主要解决的问题：克隆了Ad7wzl基因组中主要序列并进行分析；利用细菌内同源重组技术构建了Ad7感染性克隆。为重组7型腺病毒载体的构建奠定了基础，并为进一步探讨Ad7感染性克隆在基因治疗及疫苗研究方面提供方法。8 温州医学院硕士学位论文第一部分7型腺病毒温州株基因组主要序列分析材料与方法1材料1．1质粒与菌株：1、菌株：E．coliDH．5a为本实验室保存。2、质粒：pMDTM18一TSimpleVector：即T-A克隆载体购自TaKaRa公司(日本)。载体pMDTM18一TSimpleVector序列及模式图如下(详见附录一)：魂岫ES彳咐3-q榉婚写—舒脯rp～·MOAOCOOM,TAAC,S姨TTTCACAC,,*,Ga——一量co—v·一～一■Cbn．’口S甜e一燃，—一辱艘瑙譬G^GC翻；^1^^C▲^rTTC^C^C^GG^‘K麓C啊^TG^0C鼻TG^1TJlcGI^CTCGHX用嘲TTCCC霸GCG盯CCTCTBq^G^T^T蛔CC^CnGoCGTC柏‘6cTTC丌了GGC^cTGGCCGTCGrn_r^CAACGTC)GTGACTG㈣GGcG，～C^GC^I奢∽Cernloa缸^CCeC矗翻BEST—S瓤p叫'嘲P瑚n-H13J17}}。{钟鳓孵by黼Vl。i‘g。l‘S9。鲈01社cll”T01．霉tC々g．t钾。。Otj‘-!(Tfa捌nasI螗}图1—1pMDTM18-TSimpleVector序列及模式图3、细胞株：A549细胞株(人肺癌上皮细胞)购白中国科学院上海细胞库。1．2丰要材料和试剂：1、工具酶：DNA聚合酶ExTaq、RNaseA、蛋白酶K等购自TaKaRa公司(日本)。2、限制性核酸内切酶BamI、NotI、EcoRI、HindIII、SmaI、XbaI、MunI等购自上海牛工牛物有限公司。3、DNAMarker：XDNA／HindlII，(500—15000)widerangMarker、100bpMarker及lkbMarker等均购自大连TaKaRa公司。9 温州医学院硕上学位论文4、人全血基因组DNA的提取试剂盒、TaKaRaLATaq仪withGCBuffer，TaKaRaMiniBESTViralRNA／DNAExtractionKitVer．3．0、离心柱型质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR试剂(dNTPloxbuffer、MgCl2、dNTP)、CompetentCellPreparationKit等均购自大连Ta№公司。5、细胞培养用试剂：高糖DMEM培养基、F．12培养基等购111Gibeo公司，标准胎牛血清购自TBD生物技术公司，胰酶、青霉素和链霉素等碧云天生物技术公司。6、琼脂糖凝胶(BIOWESTAGAROSEREGULAR，西班牙)、无水乙醇、Tris．饱和平衡酚、氯仿、异戊醇、甘油、青霉素和链霉素等均为国产分析纯由本实验室提供。1．3主溶液及培养基配制1、LB培养液及培养基成分量酵母提取物胰蛋白胨NaCl5g10g10g加双蒸水至950ml，用10MNaOH调pH值至7．O～7．2，加双蒸水定容至1000ml，15磅高压灭菌20---30rain，置4℃储存备用。在每升LB液体中加入15g琼脂粉即为固体LB培养基。2、手工质粒小提中溶液的配制：1)溶液h50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8．0)，10mMEDTA(pH8．O)。2)溶液II：0．2MNaOH，1％SDS(临用前l：1配制)。3)溶液III：60ml5M乙酸钾，11．5ml冰乙酸，28．5砌蒸馏水。3、TE缓冲液0H8．0)：10mM'Iris—HCl，10mMEDTA0H8．0)。4、琼脂糖凝胶电泳缓冲液(50xTAE)：Tris2429，冰醋酸57．1ml，EDTA(0．5mol／LpH8．0)100ml，使用时用蒸馏水稀释50倍。5、细胞培养用试剂：1)细胞培养液：含10％FBS、1％双抗(青霉素终浓度lOOU／ml，链霉素终浓度100¨g／m1)的高糖DMEM培养液或F．12培养液。2)细胞维持液：仅将细胞培养液中的FBS浓度改为5％。3)细胞冻存液：含60％FBS、10％DMSO的高糖DMEM培养液或F12培养液6、PEG8000(20％，1MNaCl)的配制：NaCl14．619、PEG8000209，三蒸水加到100ml，加热溶解，于4℃冰箱内备用。lO 温州医学院硕士学位论文1．4主要仪器l、生物安全柜(TherrnoForma的1169型)2、AIRTECH超净工作台(苏静集团安泰公司)：3、Microfage22R型离心机(美国BECKMANCOULTER)：4、落地超速离心机(BeckmanCoulter的OPTIMAL．100XP)：5、MyCyclePCR仪(美国BIO—RAD公司)；6、GENEGENIUS生物成像系统(英国SYNGENE公司)：7、Du一800核酸／蛋白分析仪(美国BECKMANCOULTER)：8、NikonDS．5M．L1显微摄影系统；The=rmo二氧化碳培养箱；9、SANYO生物医学冷柜(日本SANYO公司)；10、DYY-5型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)；11、HANGPINCFA2004分析(程量)天平(上海精科天平实业有限公司)；12、优普超纯水机(优普公司)：13、HZQ．X100振荡培养箱(哈尔滨东联电子科技开发有限公司)等。2方法克隆Ad7wzlITR-L、E1A261R、EIB55kDa、Hexon、E3和ITR-R六个基因并测序，通过Bioexiit软件分析比对，进而进行Ad7wzl基因组主要序列分析。2．1Ad病毒株的分离培养、病毒基因组DNA的提取及酶切鉴定2．1．1A549细胞的培养A549细胞培养在含10％FBS的F-12培养基中，所有培养基均添加100U／ml青霉素和100I_tg／ml链霉素，细胞为贴壁生长，在饱和湿度、5％C02、37"C细胞培养箱中培养。2．1．2Ad病毒株的分离培养痰液标本采自温州医学院附属育英儿童医院2岁肺炎患儿，取500山与等量含双抗的PBS缓冲液混匀并反复冻融3次，2000r／min离心20rain，取上清液。六孔板中A549细胞长成单层后，吸弃含10％d、牛血清的F12培养液，以PBS洗涤2次。加入标本上清液500山吸附1h，换以5％小牛血清的F12培养液维持。常规37℃培养并逐日在倒置显微镜下观察细胞生长情况。一般在感染后5．7天即可看到明显的细胞裂解或CPE现象。当繁殖病毒的细胞出现80％．100％的CPE时，收获并反复冻融三次使细胞破裂释放出病毒，4000rpm离心10分钟，取其上清，即得到Ad病毒株。2．1．3病毒基因组DNA的提取 温州医学院硕士学位论文病毒上清液加入等量的PEG8000(20％，1MNaCl)，4℃过夜。次日，4℃120001pm离心30min，去上清，沉淀溶于4001．d蛋白质裂解液(5％SDS，20mmol／LEDTA，50“g／ml蛋白酶目，56℃水浴lh后，加等体积的嘣s．饱和酚，混匀12000rpm离心lO分钟，取上清反复抽提至界面无蛋白质为止，然后加2倍预冷无水乙醇及O．1倍体积的醋酸钠(3M，PH5．2)，沉淀核酸，-20℃过夜，12000rpm离心30min后，核酸沉淀再用70％乙醇洗涤两次，晾干乙醇，将沉淀用20¨l含10099／mlRNascA的无菌水溶解，37℃孵育30rnin，即得到腺病毒的基因组DNA。取少量用紫外分光光度计测其含量和纯度，其余置--20"C贮存备用。2．1．4Ad基因组DNA的限制性酶切及电泳：病毒DNA基因组分别用BamHI、HindIII和Sinai进行酶切，产物用0．7％琼脂糖凝胶电泳检测。其反应体系如下：·ReagentsVblumeAd7wzlDNABamI-II(10U／lal)Y+／Tang∥BufferddH205斗l1肛l21．1upto20山ReagentsVolumeAd7wzlDNAHindIII(10U／I．d)Y+／TangoTMBuffcrddH2051．tllJll2plupt020plReagentsvolumcAd7wzlDNASinai(10U／I．t1)Y+／TangoTMBufferddH2051．tllpl21．1upt020p．137℃酶切2h后电泳鉴定。根据Ad病毒株基因组酶切分型结果，将本文分离得到的病毒株命名为12 温州医学院硕士学位论文Ad7wzl(7腺病毒温州株)。2．2克隆Ad7wzlITR-L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3和ITR—R六个基因2．2．1引物设计并合成：参照发表的Ad7基因组全序列AY495969，利用Primer5．0软件设计六对PCR引物(表1)并合成。表lAd7wzl病毒株主要基因片段的引物序列、酶切位点及所在基因组位置2．2．2PCR反应及回收反应体系如下：ReagentsVolumeTaKaRaExTaq(5Wrtl)10xExTaqBuffer(MgZ+Pius)dNTPMixture(各2．5mM)Ad7wzlDNAP1(20肛M)P2(20pM)ddH，o0．25IIl5山4pl2lal1IIl1山upt050肛l13 温州医学院硕士学位论文ReagentsVolumeTaKaRaExTaq(5u／}Io0．25山10xExTaqBuffer(M92钠哟5lxldNTPMixture(各2．5mM)4山E1Aa，E1AbPCR回收产物2山P3(：0山田1山P4(20gM)1山ddHzOupt050UlReagentsVolume(91)TagaRaLATaq(5U／O)0．5山2xGCBufferI25mdNTPMixture(各2．5raM)、-8mAd7wzlDNA2mP5(20州)1山P6(20“M)，1IllddH20upto50mReagentsVolumeTaKaRaExTaq(5U／肛D0．25山10xExTaqBuffer(M矿+Plus)5肛ldNTPMixture(各2．5mM)4glAd7wzlDNA2ulP7(20pM)1$tlP8(20肛M)1glddHeOupto50”I14 温州医学院硕士学位论文ReagentsVolume(td)TaKaRaLATaq(5u／．D2xGCBufferIdNTPMixture(各2．5mM)Ad7wzlDNAv9(20gM)PlO(20州)ddH200．5山25山8m2ulIIll1plupto50plReagentsVolumeTaKaRaExTaq(5Uhd)10xExTaqBuffer(M92。Plus)dNTPMixture(各2．5raM)Ad7wzlDNAP11(20“M)P12(20州)ddH2025山5山4IIl2lll1IIl1mupto50山PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性lmin，55℃退火lmin，72℃延伸lmin，共30+循环，最后一个循环72℃延伸10rain，扩增片段分别约为E1A261R(780bp)、E1855kDa(1400bp)、Hexon(250bp)、E3(1200bp)。扩增后，取2¨l反应产物经1％琼脂糖(含EB)电泳，置凝胶分析系统观察，拍照。2．2．3目的基因的纯化与回收(1)将上述PCR产物经过I％TAE缓冲液制作的琼脂糖凝胶进行电泳。(2)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。进一步切碎胶块，称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以lmg=11．tl进行计算。’(3)向胶块中加入胶块融化液DR-IBuffer，DR-IBuffer的加量为4个凝胶体积量。(4)均匀混合后75℃加热融化胶块。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约15 温州医学院硕士学位论文6～10分钟)。(5)向上述胶块融化液中加入DR-IBuffer量的1／2体积量的DR-IIBuffer，均匀混合。(6)将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。(7)将上述操作5的溶液转移至SpinColumn中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。(8)将500I，d的RinseA加入SpinColumn中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液。(9)将700pl的RinseB加入SpinColumn中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液。(10)重复第9操作步骤。(11)将SpinColumn安置于新的1．5llll的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入25山的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟，事先把灭菌蒸馏水加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。(12)12000rpm离心1分钟洗脱DNA。2．2．4各目的基因与椰肛膨18-TSimpleVector载体连接按TaKaRa公司的pMD'ru18．TSimpleVectori式剂盒说明书进行T载体与六个目的基因分别连接，连接反应体系：ReagentsVolumepMDTMl8．TSimpleVectorITR-LPCR回收产物SolutionIddH201pl2山5Ⅲupto10山ReagentsVrolumepMDTM18．TSimpleVectorE1A261RPCR回收产物SolutionIddH201m2lxl5plupto10山16 温州医学院硕士学位论文ReagentsVolumepMDTM18-TSimpleVectorE1855kDaPCR回收产物SolutionIddH201pl2山5mupto10plReagentsVrolumepMDTM18．TSimpleVectorHexonPCR回收产物SolutionIddH201山2IIl5IIlupto10山ReagentsVP0lumepMDTMl8．TSimpleVectorE3PCR回收产物SolutionIddH201山2m5山upto10plReagentsvolumepM∥18-TSimpleVectorn’R．RPCR回收产物SolutionIddH201IIl2m5山upto10pl连接反应体系于16℃过夜。2．2．5转化l、E．coliDH．5ct感受态细胞的制备：11．菌种纯化①使用LB／抗生素平板培养基(根据菌种性质加入适当的抗生素)，用接种针挑取大肠杆菌(-70"C甘油保存菌)BJ5183，在平板培养基上分级划线，以能够出现单菌落为宜。、17 温州医学院硕士学位论文②将上述划线的平板培养基倒置于恒温培养箱中37"C过夜培养。2)菌体培养’①取20mlq’bxbroth移至100ml三角烧瓶中，塞上棉塞后高温高压灭菌，然后冷却至室温。②在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到①的培养基中。③37℃振荡(约240rpm)培养。④测定OD值，当OD值达到0．35""0．5时(约培养5小时)放置冰中停止培养(如果OD600值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率)。⑤进行下一步操作。3)感受态细胞的制备(根据TakaraCompetentCellPreparationKit操作)①取上述菌体培养液1ml于1．5mlMicrotube中。②1,500xg4"C离心5分钟，弃上清。③在每个Microtube中加入100ul冰中预冷的SolutionA，轻轻弹动Microtube使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。④1,500×94。C离心5分钟，弃上清。⑤在每个Microtube中加入100ul冰中预冷的SolutionB，轻轻弹动Microtube使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。⑥感受态细胞制作完成于．80"C中保存，以备以后使用。2、连接反应产物的转化1)取100I-tl感受态细菌6管，分别加入上述连接产物，轻轻摇匀，冰浴30min。2’l42℃热休克90-120秒，快速转移至冰水浴中，冰浴3-5min，31加入900rdSOC液体培养基，摇匀，4)37℃100rpm振摇培养1小时。5)分别用LB液体培养基稀释10倍，100倍，并各取0．1m1分别涂于LB(Amp+)的平板上。6)待菌液完全吸收后，37℃下倒置培养皿培养12—16h。2．2．6重组质粒pMDl8Ts．ITR-L、pMDl8Ts．E1A261R、pMDl8Ts-E1855kDa、pMD18Ts—Hexon、pMDl8Ts．E3、pMD18Ts—ITR-R的提取和双酶切鉴定l、碱裂解法小量质粒DNA的制备(按《分子克隆》中的方法进行)1)用接种环从LB(Amp+)平板上随机挑选几个白色单个菌落，接种于新鲜的LB液体培养基中，100-150rpm，37℃过夜。2)取1．5rnJ过夜培养菌液加入EP管中，4。C，12000rpm×1rain离心，尽弃上清。18 温州医学院硕士学位论文3)加入100山溶液l剧烈振荡，悬浮沉淀。4)加入200m溶液II轻轻颠倒几次，冰上放置5min。5)JJI]／N．1501M预冷的溶液Ⅲ轻轻颠倒几次，混匀，放置5min。6)加入0．6倍体积的异丙醇，混匀，．20℃，30min。7)4℃，12000x20min离心，弃上清，700,6乙醇洗涤两次。8)弃上清，室温干燥，使乙醇挥发干。加入20山的TE或ddH20(含有RNA酶即RNase，20p．g／m1)，溶解后备用。2、重组质粒的双酶切其反应体系如下：．Reagents‘}白lumepMDl8Ts·ITR-LBamHI(10U／id)EcoRI(10U／p1)Y+／TangoTMBufferddH2051xl21d2pl51alupto50111ReagentsV．olumepMDl8Ts·E1A261RNotI(10U／ixl)EcoRI(10U／I，d)BufferY+／TangowithBSAddH2051al11．dllal5pl印to50山ReagentsV0lumepMDl8Ts·EIB55kDaSmaI(10U／Id)XbaI(10U／I．t1)BufferY+／TangowithBSAddH2051xll“l5“lupto50I-tl19 温州医学院硕士学位论文ReagentsV0lumepMDl8Ts-E3BamHI(10U／91)MunI(1OU／Id)BufferY+／TangowithBSAddH205“l1斗llm5山upt050山ReagentsVolume(}11)pMDl8Ts—ITR-LBamH](10U／1．t1)EcoRI(10U／91)Y+／Tan90瑚BufferddH205pl29l51alupto501．tl37。C水浴酶切3h。反应完毕后在1％琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳鉴定初步正确后送至大连宝生物测序(通用引物M13)。2．3Ad7wzl基因组主要序列BLAST比对分析将测序后的六段基因序列于NCBI数据库内进行BLAST比对，与GenBank上已发表的各基因组进行相似度比较。选取近似病毒株进行具体比较分析。2．4Ad7wzl基因组主要序列同源性分析将测序后的各段序列与已在GenBank发表的五个Ad7基因组序列进行BLAST比对，并用BioEdit软件对Ad7wzlITR．L、ElA26lR、E1855kDa、Hexon、E3、ITR．R区的序列及氨基酸进行同源性分析。这五个基因组序列分别是：Adrefl： 温州医学院硕士学位论文AY495969(Humanadenovirustype7vaccines仃ain,completegenome)、Adref2：AY601634t19】(Humanadenovimstype7s仃ainNHRC1315，completegenome)、Adref3：AY594256[20】(Humanadenovirustype7vaccinestrain,completegenome)、Adref4：AY594255t211(Humanadenovirustype7strainGomen：completegenome)、AdrefS：BK005235(Humanadenovirustype7，completegenome)。2．5基因序列突变位点分析将测序后的各段序列与已在GenBank发表的五个Ad7基因组序列进行BLAST比对，并用BioEdit软件对Ad7wzlITR-L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3、ITR-R区的序列突变位点进行分析。21 温州医学院硕士学位论文结果3．1Ad病毒株的分离培养、病毒基因组DNA的提取及酶切鉴定3．1．1痰液腺病毒感染A549细胞：A549细胞于感染痰液腺病毒5～7d天后能引起细胞肿胀、变圆、聚集成葡萄串珠状的典型细胞病变(图1．2A、图1-2B)。图l一2腺病霉感染A549细胞后的细胞炳燹效应A：正常A549细胞(100×)；B：A549细胞感染后7天(100x)。3．1．2Ad7wzl基因组DNA的提取Ad7wzl病毒基因组提取DNA后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到与预期大小一致的约35kb的条带。(图1．3)MAd7wzl-35kb图1．3：Ad7wzl病毒株基因组DNA的条带M：WideRange(500·15000bp)DNAMarker：Ad7wzl：Ad7wzl基㈨组DNA3．1．3病毒基因组DNA的酶切图谱：病毒基因组DNA的BamHI、Hi门饥II和SmaI酶切图谱(图l一4)，对照国外文献，从Bamill的带型初步确定本次分离的Ad7wzl毒株为Ad7d2型【221】。 温州医学院硕士学位论文图1-4Ad7wzl基因组DNA的酶切图谱M1：1kbDNAladderMarker；M2：姆)NAHindlIIMarker；S：SmaI；H：HindIII；B：BamHI．3．2克隆Ad7wzlITR．L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3和ITR．R六个基因按常规PCR法扩增出四个片段分别为ITR．L(500bp)、E1A261R(780bp)、E1855kDa(1400bp)、Hexon(250bp)、E3(1200bp)、和ITR-R(514bp)，电泳结果显示与预期结果一致。纯化后产物与pMDl8．Tsimple18．Tvector载体克隆后用相应限制性内切酶鉴定。结果均与预期大小一致。提示基因ITR．L、E1A261R、E1855l(Da、Hexon、E3和ITR．R被克隆／X,pMDsimple18．Tvector中，表Ij)]pMDl8Ts．ITR．L、pMDl8Ts—E1A261R、pMDl8Ts—E1855kDa、pMDl8Ts—Hexon、pMDl8Ts—E3和pMDl8Ts—ITR．R载体构建成功(图1．5A．F)。(A)(D)隧哆：遂荔藜矧麟I震鬻}蒸溱鬻鬻豢|(B)～2．7kb—O．5kb(E)～2．7kb～O．25kb(C)～2．7kb—O．78kb，一2．7kb～1．2kb(F)，一2．7kb～1．4kb～2．7kb加．5kb图1．5Ad7wzlITR．L、E1A261R、ElB55kDa、Hexon、E3、ITR．R基因PCR及酶切图(A)ITR-L-M：WideRange(500—15000bplDNAMarker；1：pMDl8T—ITR—L／BarnH+EcoRI；2：23 温州医学院硕士学位论文ITR．LPCR．(B)EIA261R：Ml：lkbDNALadderMarker；M2：lOObpDNAMarker；1：pMDlT-EIA261R／Nod+EcoRI；2：EIA261RPCIL．(C)EIB55kDa：M：lkbDNAMarker；1：EIB55kD主PCR；2：pMDl8T-E1855kDa，Sinai+XbaI(D)Hexon：M：lkbDNAMarker；l：PMDl8T-Ad7-Hexon／BamHI+EcoRl2：HexonPCR．(E)E3：M：WideRange(S00-15000bp)DNAMarker；,1：E3PCR；2：PMDl8T-E3／BamHI+MuM．(F)ITR-R：M：WideRange(500-15000bp)DNAMarker；1：ITR-RPCR；2：pMDI8T-ITR-R／Nod+EcoRI．Ad7wzlITR-L、EIA261R、EIB55kDa、-Hexon、E3和ITR-R基因克隆测序的完整cDNA序列与5个在GenBank上已发表的Ad7基因组(AY594256凹J、AY495969、AY6016341191、AY59425512¨、BK005235)经BioEdit序列比对后，结果显示与5个在GenBank已经发表的Ad7基因组序列中的相应序列高度近似(详见附录三)。3．3Ad7wzl基因组主要序列BLAST比对分析测序后的六段基因序列BLAST比对后，结果初步显示与Ad7wzl基因组主要基因与HAd7、HAd3、HAd4、SAd(包括SAd28、SAd35等)四种基因组均有着一定的相似度，通过Ad7wzl主要基因与上述四组病毒基因组平均相似度的比较，发现Ad7wzl基因组的六个主要基因与HAd7的相似度均为最高，表明本文所得到的病毒基因组为7型腺病毒。(图1．6)’120．0％100．O％80．O％60．0％40．O％20．0％0．O％ITR-LE1A261REIB55kDaHexonE3ITR—R图1-6Ad7wzI与HAd7、HAd3、HAd4、SAd基因组主要序列相似度比较翻Ad7wzI／HAd7乃Ad7wzl／HAd3羞Ad7wzl／HAd4蟛Ad7wzl／SAd3．4Ad7wzl基因组主要序列同源性分析：在BLASTLh对结果确定本实验所分离的Ad7wzl基因组为Ad7的基础上，将Ad7wzlITR．L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3、ITR．RJ塞JI．,个区域与Genebank上已发表的Ad7基因组(Adrefl、Admf2、Adref3、Adref4、AdrefS)相应序列比较 温州医学院硕士学位论文结果表明：核苷酸序列的同源性分别达到97．80／o-99．6％、99．1％-一100．0％、98．9％～99．9％、100．0％、98．8％99．6％、93．20／o-96．1％(见图1．7A)；相应ElA26lR、E1855kDa、Hexon、E3E区域的氨基酸序列同源性分别达到99．20／o-100．0％、98．6％"99．8％、100．0％、97．8％-99．8％(图1-7B)。而经统计Ad7wzl基因组平均相似度与五组参照序列比较核苷酸同源性分别为：98．6％、98．7％、98．5％、97．6％、98．6％；氨基酸同源性分别为：99．4％、99．7％、99．5％、98．7％、99．6％。102．0％100．0％98．0％96．0％94．O％92．0％90．0％88．0％Ad7wzl／AdreflAd7wz1／Adref2Ad7wz1／Adref3Ad7wzl／A血e14Ad7wz1／Adre-f5ITR-LE1A261REIB55kDaHexonE3ITR-R图1-7AAd7wzl主要基因与Gcnbank上已发表的Ad7基因组相应序列核苷酸同源性比较100．5％100．09699．5％99．O％98．5％98．0％97．5％97．0％96．5％^Ad7wz1／Adrefl—Ad7wzI／Adref22Ad7wzl／Adref3qAd7wzI／Adre“RAd7wzl／Adref5ElAZ6lRElB55kDaHexonE3图1．7BAd7wzl主要基因与Gcnbank上已发表的Ad7基因组相应序列氨基酸同源性比较3．5序列突变位点分析：Ad7wzl的主要基因编码区对应参照基因组序列普遍存在的突变位点并产生氨基酸突变的有：ElA261R区第613位T突变成C，造成苯丙氨酸突变成丝氨酸：E1A261R区第744位C突变成G，造成谷酰胺突变成谷氨酸；ElB55kDa、第2008 温州医学院硕：士二学位论文位G突变成A，造成精氨酸．赖氨酸；E3区30579．30581位(参照Ad7refl)与Adrefl、Adref2、Admf4、Adref：5比较都发生C、T、A三个碱基连续缺失，造成移码突变，而与Adref3比较没有发生缺失(表2，图1．8)。另外E3区30209．30210(参照Ad7refl)位碱基序列与Adrefl、Adret2、Adref3、Adref5比较都发生C、T缺失，其中与Adref2比较是发生C、T、G三个位点连续缺失，而与Adref4比较没有缺失此区属于非编码区而不影响蛋白表达。表2Ad7wzlEIA261R、E1855kDa、E3编码区基因主要突变位点及氨基酸变异AdwzlAdreflAdref2Adret3Adrff4Adref5叩tct0c▲喀O-AtTIl^^tTddSATCC尊’▲^tCTT613CC744GT613CC744GC744002008AG2008AG200&A30579·3058ldcICAT30164．30166delCAT30368-30370deleAT30579．3058lddCATE1A261RElA261RElB55kDaE3图1．8AdwzlE1A261R、E1855kDa、E3编码区基因主要突变位点峰图C尊l尹。CfCe 温州医学院硕士学位论文第二部分7型腺病毒感染性克隆的构建材料与方法：l材料1．1质粒与菌株、细胞株：1、菌株：E．coliDH．5值、EZl0、E．coliBJ5183为本实验室保存。2、质粒：pMDTM18-TSimpleVector：即T-A克隆载体购自TaKaRa公司(日本)，序列及模式图(详见附录一)。载体pXbl为本实验室构建保存，模式图(详见附录二)。3、细胞株：A549细胞株(人肺癌上皮细胞)购自中国科学院上海细胞库。1．2主要材料和试剂l、限制性核酸内切酶BamI、NotI、EcoRl、Pmel等购自上海生工生物有限公司。2、脂质体：Lipofectamine2000购自Invitrogen公司(美国)3、其它试剂(参照第一部分)1．3主要溶液及培养基配制l、PEG8000(20％，IMNaCI)的配制：NaCI14．619、PEG8000209，三蒸水；hni至0lOOml，加热溶解，于4。C冰箱内备用。2、其它溶液(参照第一部分)1．4主要仪器(参照第一部分)Bafn硒Afal．．■_IlBamHlI二]EcoRIITR-L(-520bp)·—___一EcoRIINotlITR-R(～500bp) 温州医学院硕j二学位论文(b)(C)Bam_IBAdLRPCRBamHIECORV护删otI28NotI 温州医学院硕：I：学位论文BBamt-l／·●____·EcoRIZIBamHIAdr(2200bp)·●—_·NotINotI【乙圆EcoRIAdl(1800bp)NotI(13420)Ad7genomicDNA(-35kb)HomologusRecombinationinBJ518329EcoRI(30773) 温州医学院硕士学位论文CTransformationintoEZl0Strain力，．IsolationLargeQuantitiesofPlasmid删TransfectionintoA549Celllines藿萤图2-17型腺病毒感染性克隆构建示意图2方法在第一部分Ad7wzl基因组序列分析的基础上，构建Ad7感染性克隆。首先胶回收第一部分克隆的基因ITR．L和ITR．R，构建穿梭载体pXbl．ITR-L—ITR-R；进而利用pMDTM18-TSimpleVector构建穿梭载体pMD18Ts-Adl-Adr，最后通过穿梭载体pMDl8Ts-Adl-Adr与Ad7wzl共转化与E．coliBJ5183构建Ad7感染性克隆并转染A549细胞鉴定其感染性。2．1穿梭载体pXbl．ITR-L．ITR—R的构建(见图2—1Aa)l、线性化的pXbl载体与ITR．L、ITR．R连接反应体系：连接反应16℃过夜。2、感受态的制各和连接产物转化取100ttl已制备的感受态细菌，加入上述连接产物，轻轻摇匀，冰浴30min。42℃热休克90．120秒，快速转移至冰水浴中，冰浴3．5分钟，再加入900I_tlSOC液体培养基，摇匀，37‘C100rpm振摇培养lh。分别用LB液体培养基稀释10倍，100倍，并各取0．1m1分别涂于LB(Amp+)的平板上。待菌液完全吸收后，37"C下倒置培养皿■■■■■■●，●■■■■■■， 温州医学院硕士学位论文培养12—16d'．时。3、穿梭载体pXbl—ITR-L-ITR-R的提取和酶切鉴定1)pXbl．ITR-L-ITR．RBamHI、Nod双酶切反应，其反应体系如下：ReagentsVolume(1a1)pXbI-ITR-L-ITR-R5pIBamHI(10U／I．t1)l¨lNotI(10U／p1)llxlY+／Tang—Buffer21alddI-120upto20p．1于37℃，酶切3h。反应完成后，酶切鉴定。2)pXbl．ITR-L—ITR．RBamHI、EcoRI双酶切反应，其反应体系如下：ReagentsVolumepXbl—ITR-L-ITR-RBamHI(10U／lal)EcoRI(10U／p1)Y+／Tango■BufferddH205Ⅲltxlllal2弘lupto201ttl于37"(2，酶切3h。反应完成后，酶切鉴定。3)pXbl—ITR-L．ITR-RNotI、EcD砒双酶切反应，其反应体系如下：ReagentsVolumepXbl—ITR-L-ITR-RNotI(10U／I．t1)EcoRI(10U／lal)Y+／Tango俐BufferddH205lxl1lal1pl2Ixlupto201fl于37℃，酶切3h。反应完成后，酶切鉴定。2．2构建含BamHI、NotI两个限制性内切酶切位点的重组载体pMDl8Ts．AdLR(见3l 温州医学院硕士学位论文图2．1Ab)。1、引物设计并合成根据Ad7基因组序列，用Primer5．0，设计一对特异性引物：AdL：P13：5’一CGGGATCCGGGTITAAACTGTGTGGTGATrGGCTGTGGGGTT-3’(与曲AY495969同源)：AdR：P14：5’．Ar]门?GCGGCCGCGGGTll’AAAGATGTGACGl’ACCGTGAGAAA@蝎G．3’(与gbAY495969同源)P13，P14的5’端分别添力n-J"BamHI、NotI两个限制性内切酶切位点并在酶切位点前面加有两个保护碱基。引物由上海捷瑞合成。用无菌去离子水将引物溶解，储存浓度为100umol／1．使用浓度为20umol／l。2、用引物P13、P14，以已构建的穿梭载体pXbl-AdIL-AdLR为模板PCR扩增得到含BamHI和NotI位点的片段AdLR，并回收。1)反应体系：ReagentsVolumeTaKaRaExTaq(5U／}lI)10xExTaqBuffer(M92+Plus)dNTPMixture(各2．5raM)模板pXbI-AdIL-AdIRP13(20山田P1420“M)ddl{200．25山5山4山2山1山1rtlupto50山2)PCR反应及回收：95℃预变性5min，94℃变性lmin，55℃退火lmin，72℃延伸lmin，共30个循环，最后一个循环72℃延伸10min，扩增片段约为800bp。扩增后，取10}．tl反应产物经1％琼脂糖(含EB)目g泳，置凝胶分析系统观察，拍照，利用TaKaRa胶回收试剂盒进行切胶回收，得到25山回收产物(取2山电泳鉴定)，备用。3、目的基因AdLR与pMD'rM18．TSimpleVector载体连接按TaKaTa公司的pMD删18．TSimpleVector试剂盒说明书进行T载体与目的基因的连接，连接反应体系：32 温州医学院硕士学位论文ReagentspMDTM18一TSimpleVector目的片段AdIRY+／TangoTMBufferddH202ttl5肛l101L11upto20I．tl连接反应16"C过夜。4、转化取1001．tl已制备的感受态细菌，加入上述连接产物，轻轻摇匀，冰浴30min。42"C热休克90．120秒，快速转移至冰水浴中，冰浴3．5分钟，再加入900I．tlSOC液体培养基，摇匀，37"C100rpm振摇培养lh。分别用LB液体培养基稀释10倍，100倍，并各取O．1m1分别涂于LB(Amp+)的平板上。待菌液完全吸收后，37"C下倒置培养皿培养12．16小时。5、重组质粒pMDl8Ts．AdLR的提取和酶切随机挑取转化平板上的白色透明单个菌落接种于3mlLB(Amp+)液体培养基中37"(2培养过夜，按碱裂解法提取质粒，然后进行双酶切，其反应体系如下：1)pMDl8Ts—AdLR质粒BamHI、NotI双酶切ReagentspMDl8Ts-AdLRBamHl(10U／lxl)NotI(1OU／Ixl)Y+／TangoTMBufferddH205ltlllttl11．tl2肛lupto20I．tl37"C水浴酶切3h。反应完毕后在1％琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。2)pMDl8Ts．AdLREcD耐单酶切ReagentsVolumeotl)pMDl8Ts-AdLREcoRI(10U／pI)Y+／TangoTMBufferddtl205pllpl21．tlupto201al37"C水浴酶切3h。反应完毕后在1％琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。 温州医学院硕士学位论文厂6、重组质粒pMDl8Ts-AdLR双酶切并回收线性化pMDTM18-TSimpleVector。重组质粒pMDl8Ts．AdLR用双酶切(BamHI．Notl)方法获取目的基因，酶切反应产物于1％琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切割目的DNA片段，并有TaKaRa公司胶回收试剂盒进行回收，以备后用。2．3穿梭载体pMDl8Ts-Adi．触的构建(图2．1Ac)2．3．1腺病毒基因组左右同源臂片段Adl和Adr的克隆1、引物设计：根据Ad7基因组序列，用Primer5．0，设计两对特异性引物：Adl：上游引物：P15：5’．TrGCGGCCGCGGG删44CCaCTCTCT＆n盯IAAI=f蛆ACCrn蛆’AG—(I’GGA-3’(与gbAY495969同源)；下游引物P16：5’．CCGAATTCCTCTGTTCTGTCCACTGGTCGTA．3’(与曲AY495969同源)。P15的5’端添加了NotI、Pmel两个限制性内切酶没切位点并在酶切位点前面加有两个保护碱基，P16的5’端添加了EcoRI限制性内切酶没切位点并在酶切位点前面加有两个保护碱基。引物由上海捷瑞合成。用无菌去离子水将引物溶解，储存浓度为100umol／1．h使用浓度为20umol／1。Adr：上游引物P17：5’一CCG制乃’。GAGTTGCTTCCTGAC筒广rCTCGTAT一3’(与gbAY495969同源1；下游引物P18：5’．CGGGATCCGGGTTTAAACCCCTCTCTATATAATATACCT，】×rAGA．3’(与gbAY495969同源)。P17的5’端分别添加了EcoⅪ限制性内切酶切位点并在酶切位点前面分别加有两个和四个保护碱基，P18的5’端添加了BamHI、Pmel两个限制性内切酶没切位点并在酶切位点前面加有两个保护碱基。引物由上海捷瑞合成。用无菌去离子水将引物溶解，储存浓度为lOOumol／1使用浓度为20umol／1。2、PCR反应1)反应体系ReagentsVolume(111)TaKaRaLATaq(5u／I_ti)2xGCBufferIdNTPMixture(各2．5raM)Ad7wzlDNAP15(20gM)P16(20ruM)ddH，O0．5山25斗l8lal2m1山1lalupt050pl 温州医学院硕士学位论文ReagentsVolume(1d)TaKaRaLATaq(SU／I．t1)2xGCBufferIdNTPMixture(各2．5raM)Ad7wzlDNAP17(20小)m8(20心DddH200．5山25山8ltl100ng1ltl1山upt050“l2)PCR反应条件：95℃预变性5rain，94℃变性lmin，55℃退火lmin，72℃延伸lmin，共30个循环，最后一个循环72℃延伸10min，扩增片段分别为-2200bp、～1800bp。扩增后，取21xl反应产物经1％琼脂糖(含EB)电泳，置凝胶分析系统观察，拍照，利用TaKaRa胶回收试剂盒进行切胶回收，得到25山回收产物(取21al电泳鉴定)，备用。3、目的基因Adl和Adr分别与线性化的pMDTM18一TSimple载体连接反应体系如下：’ReagentspMDl8一T载体目的片段Y+／TangoTMBufferd‘狂120total2斗l59l10m31tlupto209l连接反应16℃过夜。4、感受态的制备和连接产物转化取100I．tl已制备的感受态细菌，加入上述连接产物，轻轻摇匀，冰浴30min。42℃热休克90．120秒，快速转移至冰水浴中，冰浴3．5分钟，再加入9001xlSOC液体培养基，摇匀，37℃100rpm振摇培养lh。分别用LB液体培养基稀释10倍，100倍，并各取0．1m1分别涂于LB(Amp+)的平板上。待菌液完全吸收后，37。C下倒置培养皿培养12．16小时。5、重组质粒pMDl8Ts．Adl、pMDl8Ts—Adr的提取和酶切回收随机挑取转化平板上的白色透明单个菌落接种于3mlLBCAmp+)液体培养基中35 温州医学院硕士学位论文37"(2培养过夜，按碱裂解法提取质粒，然后进行双酶切，其反应体系如下：反应体系入下：于37"(2，酶切3h，电泳鉴定初步正确后送至上海生工公司测序(通用引物M13)。按前述方法回收纯化载体片段。2．3．2穿梭载体pMDl8Ts-Adl-Adr的构建l、线性化的pMDl8Ts—AdLR载体分别与Adl、Adr连接反应体系：ReagentsVolume线性化的pMDl8Ts-AdLRAdlAdrT4BufferT4LigaseddH2021114pl21allplupto20pl连接反应16℃过夜。2、感受态的制备和连接产物转化取100肛1已制备的感受态细菌，加入上述连接产物，轻轻摇匀，冰浴30min。 温州医学院硕上学位论文42"(2热休克90-120秒，快速转移至冰水浴中，冰浴3-5分钟，再加入9001ASOC液体培养基，摇匀，37"(2lOOrpm振摇培养1h。分别用LB液体培养基稀释10倍，100倍，并各取0．1m1分别涂于LB(Amp+)的平板上。待菌液完全吸收后，37"C下倒置培养皿培养12．16小时。3、穿梭载体pMDl8Ts．Adl-Adr的提取和酶切鉴定随机挑取转化平板上的白色透明单个菌落接种于3mlLB(Amp+)液体培养基中37"(2培养过夜，按碱裂解法提取质粒，然后进行双酶切，其反应体系如下：反应体系如下：1)pMDl8Ts．Adl．AdrBamHI、NDfI双酶切反应，其反应体系如下：ReagentsVolumepMDl8Ts··Adl-·AdrBamHI(10U／ld)NotI(10u／a1)Y+／TangoTMBufferddH205ttl1山21dupto20}tl于37℃，酶切3h。反应完成后，电泳鉴定。2)pMDl8Ts．Adl．AdrBamHI、EcDRI双酶切反应，其反应体系如_卫于37"C，酶切3h。反应完成后，电泳鉴定。3)pMDl8Ts．Adl．AdrNotI、EcoRI双酶切反应，其反应体系如下：ReagentsVolumepMDl8Ts··Adl··AdrNotI(1OU／I．d)EcoRI(i0U／Id)Y+／TangorMBufferddH2051al1mlpl2plupto201d 温州医学院硕士学位论文于37"(2，酶切3h。反应完成后，电泳鉴定。4)pMDl8Ts-Adl-AdrEcoRI单酶切反应，其反应体系如下：ReagentspMDl8Ts-Adl-AdrEcoRI(10U／ttl)Y+／TangoTMBuffer枷205ttllttl2ttlupto201．1于37℃，酶切3h。反应完成后，电泳鉴定。5、pMDl8Ts-Adl-AdrPmel单酶切反应ReagentsVolumepMDl8Ts-Adl—AdrPmel(5U／td)Y+／TangowBufferddH205ttl2ttlupto201．137℃水浴酶切3h。反应完毕后在1％琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。2．4Ad7感染性克隆的构建(见图2．1B)2．4．1重组子pMDl8Ts-Adl-Adr经EcoRI单酶切线性化并回收反应体系如下：ReagentsV．0lumepMDl8Ts·Adi-AdrEcoRI(10U／i．t1)BufferY+／TangowithBSAddH20、lO；tl5pl5ttlupto50Ⅲ。37"(2、3h，适当延长酶切时间，以保证所有病毒病毒基因组DNA被切开。反应完成后，于1％琼脂糖凝胶(回收效果较好)电泳，在长波紫外灯下鉴定酶切结果，并切胶回收pMDl8Ts-Adl．Adr经．EcDⅪ单酶切后的条带，回收步骤按TaKaRa公司胶回收试剂盒进行，得到的回收产物，取2m电泳鉴定，核酸／蛋白分析仪上测定DNA含量和纯度。 温州医学院硕士学位论文2．4．2Ad7感染性克隆的细菌内同源重组线性化的pMDl8Ts-Adl-Adr片段与Ad7DNA共转化于感受态E．eoliBJ5183中，氨卞霉素抗性平板筛选，挑取菌落培养并抽提质粒，以野生型Ad7DNA为对照，0．7％琼脂糖电泳初筛分子量大于35kbp的质粒为候选感染性克隆，经PCR鉴定初步确定阳性克隆，分别用Pmel、NotI、EcoRI单酶切鉴定后得到的阳性菌命名为pMDl8Ts-Ad7。阳性克隆质粒再次转化于菌株EZl0中进行扩增。l、线性化的pMDl8Ts．Adl-Adr片段与Ad7DNA的共转化1)将．80℃保存的BJ5183感受态细胞置于冰中融化5分钟。2)取100山的感受态细胞移至新的转化管中。3)向感受态细胞中加入O．1ng；--10ng(3m～10山)的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30分钟。4)42℃水浴中放置45秒钟后，立即于冰中放置1～2分钟。5)加入890山37℃预温的SOC培养基。6)37"(2振荡培养1小时。7)取适量涂氨卞霉素抗性平板后，将平板倒置于37℃培养箱中培养一夜。8)确认培养茵落，进行下步实验。2、Ad7感染性克隆质粒的提取并进行PCR初筛挑取较小菌落过夜振荡摇菌后按前述方法进行质粒小量提取，初筛分子量大于35kbp的质粒，以此作为模板，用引物P9、P10进行Ad7wzlE3区PCR扩增鉴定，PCR阳性结果初步确定为阳性克隆，命名为pMDl8Ts-Ad7。PCR体系如下：2．4．3Ad7感染性克隆的扩增初筛为阳性克隆质粒再转化于EZl0进行扩增，挑选单菌落进行质粒小提并进39 温州医学院硕士学位论文行琼脂糖凝胶电泳鉴定。2．4．4Ad7感染性克隆的酶切鉴定筛选出分子量大于35kbp的质粒，分别用BamHI、EcDⅪ、NotI、Pmel、单酶切鉴定，反应体系如下：‘ReagentsV．olumepMDl8％-Ad7BamI-II／EcoRI／NotI(10U／p1)BufferY+／TangowithBSAddH205ml山2plupt020山ReagentsVolumepMDl8Ts-Ad7Pmel(5U／l-11)BufferY+／TangowithBSAddH205pl2pl2mupto20肛l37。C、3-5h，适当延长酶切时间以保证所有质粒被切开，取101xl电泳鉴定。2．5Ad7感染性克隆pMDl8Ts-Ad7的感染性鉴定(图2．1C)2．5．1pMDl8Ts-Ad7Pmel线性化并回收大片段其反应体系如下：ReagentsVolumepMDl8Ts-Ad7PmelBufferY+／TangowithBSAddH2020#lOpl10Illupt0100I．tl37℃、6h，适当延长酶切时间以保证所有质粒被切开，取4pl电泳鉴定是否完全线性化，余用酚：氯仿抽提去除酶等杂质，乙醇沉淀回收DNA，紫外分光光度计法测定DNA含量和纯度。2．5．2Ad7感染性克隆pMDl8Ts-Ad7感染性的初步检测将对数生长期的A549细胞(无抗生素培养)接种到24孔培养板中，于5％C02、37℃饱和湿度条件下培养，24h后待细胞长至70．80％汇合状态时，将Pmel酶切后的线性化质粒pMDl8Ts．Ad7经由脂质体Lipofectamine2000介导共转染至A549细 温州医学院硕：t学位论文胞，以培养正常A549细胞为阴性对照。pMDl8Ts-Ad7转染具体步骤为：1)先取两个离心管(A，B)，在A管中加入l山Lipofectamine2000，B管中加入约为0．5pg的DNA片段，用无血清、无抗生素的F12定容至50山，混匀，室温下静置5min。‘t2)同时吸弃细胞培养板中原有培养液，加入3009l无血清、无抗生F12于37℃，5％C02培养箱孵育。3)质粒与脂质体稀释液静置5min后，将二者均匀混合，室温静置20min，期间每隔5min摇晃一次。4)将质粒一脂质体混合物用无血清、无抗生素的F12补齐体积至500斗增，混匀；并弃去24孔培养板中已的有培养液。5)用移液器吸取质粒．脂质体混合物缓慢加入到细胞空内。整个过程为无血清转染，37℃，5％C02培养4h。6)吸弃转染液，用PBS洗涤3遍。最后，加入新鲜细胞培养基(血清终浓度为10％)，次日换为含5％血清的新鲜细胞培养基，继续培养7．14天，每3．4天更换一次培养液。7)收获病毒：逐日显微镜镜下观察细胞形态变化，直到出现明显细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)时，轻轻吹打使细胞脱壁，将细胞和培养上清一并收集于EP管中，在．70℃和37℃之间反复冻融3次，混匀后10000rpm离心5min以去除细胞碎片和杂质，将上清转移到新的EP管中，将得到的种子病毒上清液冻存在--70℃备用。，2．5．3pMDl8Ts-Ad7重复感染性的检测将上一步收集得到的病毒夜于．70"C和37"C水浴间反复冻融3次，4℃、3500rpm离心30min去除细胞碎片，取上清再次感染生长至90％汇合状态的A549细胞，以培养正常A549细胞作为对照，逐日显微镜镜下观察细胞形态变化，直到出现明显细胞病变。4l 温州I医学院硕{：学位论文结果3．1穿梭载体pXbl．ITR．L．ITR．R的构建穿梭载体pXbl．ITR．L—ITR—R经BamHI、EcoRI和NotI、EcoRI双切后都得到约O．5kb和约7．5kb条带，经BamHI、NotI双切后得到条带约1kb和约7kb条带，提示基因AdlL和AdlR被克隆入pXbl中，表明pXbl．ITR．L．ITR．R载体构建成功(图2．2)。M1238kb0．75kb0．5kb图2-2：穿梭载体pXbl-ITR·L·ITR-R酶切M：(500·15000)widerangMarker；1：pXbl—ITR-L-ITR·RBamHl-EcoRl双切：2．pXbl-ITR·L-ITR-RNotI-EcoRl双切：3．pXbl—ITR—L-ITR-RBamHI·NotI双切。3．2重组载体pMD18Ts．AdLR的构建重组载体pMDI8Ts．AdLR经BamHI、Notl双切后都得到约0．8kb和约2．7kb条带，提示基因AdLR被克隆入pMDTM18一TSimpleVector中，表明pMDl8Ts-AdLR载体构建成功(图2—3)。M12．滋0．7kb～2．7kb--43．8kb图2-3：重组载体pMDl8Ts·AdLR双酶切糁定图M：lkbDNAMarker；1：pMDI8Ts—AdLRBamHl—Notl舣酶切42 温州医学院硕士学位论文3．3穿梭载体pMD18Ts．Adl．Adr的构建3．3．1目的基因Adl和Adr的获得通过PCR反应分别扩增目的基因Adl和Adr，大小分别约为2．2kb和1．8kb，与预期结果一致；经过与pMDsimple18．Tvector(-2．7kb)载体的连接、转化后形成克隆质粒pMDl8Ts．Adl和pMDl8Ts．Adr。质粒分别经BamHI、EcoRl和NotI、EcoRI双酶切后，电泳显示分别有两个片段，小片段分别约2．2kb和1．8kb，大片段约2．7kb，提示基因Adl和Adr被克隆入pMDsimple18．Tvector中，表明pMDl8Ts．Adl和pMDl8Ts—Adr载体构建成功(图2-4)。M12344kb2．5kb2kb-2．2kb～1．8kb图2-4：目的基因Adl和AdrPCR及T载体质粒酶切M：lkbDNAMarker．1：AdlPCR；2：质粒pMDl8Ts-AdlNotl—EcoRl双酶切；3：AdrPCRr4：质粒pMD18Ts-AdrBamHl-EcoRl双酶切3．3．2穿梭载体pMDl8Ts．Adl．Adr的构建最终获得的病毒穿梭载体pMDl8Ts．Adl．Adr经NotI．EcoRI双切电泳显示约2．2kb和4．5kb条带，提示Adl片段克隆进pMDa-M18．TSimpleVector载体，经BamHI．EcoRI双切电泳出现约1．8kb和约4kb等四个条带，提示Adr片段克隆进pMDTMl8．TSimpleVector载体，经Pmel单切电泳显示约4kb和2．7kb两个条带，提示Adl．Adr成功克隆替换前期构建的质粒pMDl8Ts．AdLR中AdLR片段，即克隆Ad7左侧约2．2kb片段及右侧约1．8kb片段。表明病毒穿梭载体pMDI8Ts—Adl．Adr构建成功(图2．5)。43 5kb4kb2．5kb2kb1kb温州医学院硕士学位论文M12345图2-5：穿梭载体pMDl8Ts—Adl-Adr酶切图M：lkbDNAmarker：1：pMDl8Ts．Adl-Adr质粒；2．pMDl8Ts-Adl·AdrNotI—EcoRI双切；3pMDl8Ts．Adl．AdrBamHl．EcoRl双切；4．pMDl8Ts-Adl-AdrEcoRl单切；5．pMDl8Ts-Adl—AdrPmel单切3．4Ad7感染性克隆的构建3。4．1Ad7感染性克隆的初筛Ad7感染性克隆质粒小提后，挑选琼脂糖凝胶电泳显示大于35kb的质粒，以此为模板，以Ad7wzlE3区引物P9、P10扩增，结果得到约1200bp条带，初步表明此为阳性克隆PMDl8Ts．Ad7(图2．6)。lkb——◆～1．2kb图2-5：7型腺病毒感染性克降PCR鉴定图M：IkbDNAMarker；1：PMDl8Ts—Ad7plasmidE3PCR3．4．2Ad7感染性克隆酶切鉴定Ad7感染性克隆PMDl8Ts．Ad7经NotI(左端插入一个位点，基因组13420处 温州医学院硕士学位论文存在一个位点)单酶切电泳显示约13kb和25kb的条带，经Pmel单酶切电泳显示远大于35kb的条带和约2．7kb的小条带，经BamHI(右端插入一个位点，基因组749等处共存在9个位点)单酶切后电泳显示多条带型，电泳结果均与预期结果一致，提示Ad7基因组DNA成功克隆进pMDTM18．TSimpleVector。表明Ad7感染性克隆PMDl8Ts．Ad7构建成功(图2．7)。-35kb-25kb～13kb123456M●23．1kb●——一9．4kb●—一6．5kb图2．7：7型腺病毒感染性克隆酶切图I：Ad7DNA：2：PMDl8TS．Ad7；3：PMDl8Ts．Ad7BamHI；4：PMDl8Ts．Ad7E∞砌；5：PMDl8TS·Ad7NotI：6：PMDl81I-Ad7Pmel；M：VHindlllDNALaddarMarker3．5Ad7感染性克隆PMDl8Ts．Ad7的感染性鉴定3．5．1Ad7感染性克隆PMDl8Ts．Ad7的感染性初步检测PMDl8Ts．Ad7经Pmel线性化后无水乙醇回收，转染A549细胞进行Ad7病毒基因组质粒的感染性鉴定，正常A549细胞作为正常对照，经倒置显微镜观察，转染3天后开始出现空泡，5天后出现大部分拉丝状病变，7天后出现葡萄串珠状病变，与野牛型Ad7感染A549细胞出现的病变形态一致，初步表明所构建的Ad7感染性克隆PMDl8Ts—Ad7具有病毒感染性(图2—8)。45 温州医学院硕士学位论文(a)LinerizedPMD181's．Ad7(b)leg"A5493d5d7d图2-8：感染性克隆PMDl8Ts．Ad7转染A549细胞图(a)：线性化的PMDl8Ts．Ad7克隆转染A549细胞后分别经过3天、5天、7天的细胞病变图(100×)；(b)：为正常A549细胞图(100×)。3．5．2Ad7感染性克隆PMDl8Ts．Ad7的重复感染性检测收集PMDl8Ts．Ad7转染A549细胞病变后的病毒上清液，再次感染A549细胞以检测其重复感染能力，经倒置显微镜观察，感染3天后出现窄泡及少量拉丝状细胞病变，5天后大部分细胞成拉丝网状病变，。1小部分一了f：始出现葡萄串珠状病变，7天后细胞全部产生CPE，成葡萄串珠状病变并少数飘起。表明所构建的感染性克隆PMDl8Ts．Ad7具有重复稳定感染能力。(图2．9)。(a)pMDI8Ts-Ad7-A549(b)正常A5493d5d7d图2-9：感染性克隆PMDl8Ts．Ad7再次感染A549细胞图(a)：PMDlgTs．Ad7转染A549细胞病变后病毒上清液再次感染A549细胞分别经3天、5天、7天的细胞病变l；墼|(100x)；(b)：为正常A549细胞图(100x)。46 温州医学院硕士学位论文分析与讨论1、关于病毒基因组的分型本文通过分析限制性内切酶消化结果的带型初步确定分离得到病毒基因组为Ad7d2122l株，基因组经过BamHI、HindlII和Sinai三种限制性内切酶消化反应后，结果显示BamHI的带型为典型的Ad7d2122j株带型。在此基础上，我们假定所得基因组为Ad7基因组，参照HAd7(AY495969)基因组序列设计引物进行克隆。为进一步确定分离得到的基因组为7型腺病毒株，将克隆测序后的六段主要基因序列分别于NCBI数据库内所有序列进行BLAST比对，比对初步结果显示这些基因与HAd7、HAd3、HAd4和SAd(SAd28、SAd35等)四组基因组有着相对较高的相似度，通过与上述四组基因组平均相似度的比较分析，发现这六个基因均与HAd7有着最高的相似度，分别达到96．7％、99％、98％、100％、97．6％和93．2％，从而可以判定本文分离得到的病毒株Ad7wzl确实为7型腺病毒株。，2、关于Ad7主要基因序列分析Ad7wzl与在与GenBank已经发表的Ad7基因组相应序列比较核甘酸序列和氨基酸序列同源性分别达到93．0％---100．00,6和98．0％---100．O％，说明Ad7wzl基因组与已发表的五组Ad7全基因组序列存在着高度同源性。基因突变位点的分析表明，编码区基因E1A216R、E1855kDa和E3区共有4个位点的核酸突变普遍存在并导致了氨基酸变异。E3区EcoRI位点处的序列分析是我们构建新型腺病毒载体的一个基础，通过序列比对，发现E3区在30579．30581(参照Ad7refl)位点发生连续缺失并造成氨基酸变异的情况比较普遍，这对我们深入分析E3区序列及改造Ad7E3区构建腺病毒载体研究都有很大的帮助。3、感染性克隆构建的难题本研究完成了Ad7全长约35kb病毒基因组的感染性克隆构建，在构建过程中主要有以下几方面的难题：(1)由于Ad7基因组庞大，约35kb，难以找到合适的能够容纳较大外源基因的载体。本课题中，先是利用约8kb的pXbl质粒得不到阳性结果，骨架质粒太大导致最后的感染性克隆太大容易造成基因组断裂，后利用p删18一TSimpleVector构建感染性克隆PMDTl8s-Ad7，而pMDTM18一TSimpleVector约2．7kb，使得感染性克隆有较好的稳定性。随着大DNA片段克隆载体如酵母人工染色体(YeastArtificialChromosome，YAC)和细菌人工染色体(BacterialArtificialChrom-osome，BAC)相关技术的出现，这个问题将逐步解决。(2)感染性克隆的筛选。宿47 温州医学院硕士学位论文主菌难以适应具有毒性序列的外源基因，而且细菌具有主动选择特定病毒序列的能力，因此所克隆到的序列不具有随机性。E．coliBJ5183具有内在的同源重组机制并能稳定遗传，本文采用该菌株中进行同源重组并挑选平板较小菌落进行筛选。(3)影响感染性克隆感染性的因素。基因突变、非病毒核苷酸等都能影响病毒的感染性，因此对病毒基因组进行序列分析也是为构建感染性克隆做基础。4、关于感染性克隆的转染及验证将基因转染到哺乳动物细胞内的方法主要包括：(1)物理方法：电穿孔法、粒子轰击技术和DNA直接注射法：(2)化学方法：磷酸钙共沉淀法、DEAF．葡聚糖法和脂质体法；(3)生物学方法：腺病毒、逆转录病毒等。理想的基因转染方法应符合以下要求：(1)转染效率高；(2)PI"源基因定向导入受体细胞；(3)外源基因在宿主细胞中高效表达；(4)较高的安全性。脂质体是一种多阳离子脂质体复合物，带有多个正电荷的阳离子脂质体与DNA磷酸骨架上的负电荷相互亲和形成复合物，被细胞捕获，进入细胞内。脂质体法转染效率高，毒性小，可重复性好。转染过程中应注意质粒的纯化方法，所用DNA与脂质体的量以及转染时间，优化各项条件，以提高转染效率。本研究所采用脂质体介导法将线性化的感染性克隆PMDl8s—T-Ad7转导入A549细胞中，通过观察，在转染后5天就可以明显看到细胞发生CPE，成葡萄串珠状病变，证明感染性克隆载体整合入受体细胞中，说明该转染方法是稳定可靠的。而电击法虽然效率高但是对细胞毒性太大。5、腺病毒载体的构建策略：腺病毒载体的构建方法有三种：一是在细胞内同源重组：首先要纯化出全长的腺病毒DNA，外源基因插入到带有腺病毒基因片段的穿梭质粒中，将腺病毒DNA和重组质粒共转染表达E1基因产物的细胞中，通过噬斑筛选出重组病毒【2引。二是细菌内同源重组：将腺病毒全长DNA序列克隆骨架质粒中，转化大肠杆菌感受菌，在细菌中复制腺病毒DNA序列，然后将外源基因片段插入带适当抗性基因的真核表达质粒，将重组真核质粒线性化后，转化带骨架质粒的大肠杆菌发生同源重组，将外源基因表达盒插入腺病毒DNA中，用这种方法也可以缺失任何区段的腺病毒DNAl241。第三种方法是将稀有的限制性内切酶位点引入穿梭质粒和腺病毒骨架载体中，将外源基因克隆入穿梭质粒中，再通过酶切连接的方法将外源基因克隆入腺病毒骨架载体，转化大肠杆菌复制重组质粒，转染相应的包装细胞系后，即可产生复制缺陷型的重组腺病毒【14】。本文感染性克隆是通过细菌内同源重组构建产生，在这个基础上可以利用同源重组方法构建重组Ad7载体。 温州医学院硕士学位论文6、关于Ad7感染性克隆的应用前景及存在的问题感染性克隆的构建对于进一步研究病毒基因功能、了解病毒致病机制、改造新型病毒载体及应用于重组活疫苗等方面都提供了很好的方法策略。而Ad7感染性克隆的构建是新型重组7型腺病毒载体构建的前提和基础。腺病毒载体具宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、高滴度制备、易纯化、外源基因装载容量大等优点，已经广泛用于基因治疗及重组活疫苗等领域研究，包括肿瘤基因治疗、遗传疾病基因治疗、用于瘢痕方面的研究、辅助补充治疗，HIV、HBV等腺病毒载体疫苗研究。目前常用的主要是E1区缺失的Ad2和AdS载体，目前研制的先导艾滋病疫苗候选利用血清5型腺病毒，这种疫苗在灵长类动物身上取得了成功【13】。但是，AdS载体的一个潜在的局限性就是大部分人类个体(尤其是非洲撒哈拉人)具有对Ad5载体的预存免疫性(pre．existingimmunity)。Ad5的预存抗体能在它们完成运输工作前中和掉AdS疫苗载体【8-101。病毒特异性的中和抗体是目前怎样避免腺病毒载体疫苗研究中的一个主要的问题【251。而且该病毒受体在原发性肿瘤表面的表达水平低下，严重影响基因转导效率，因此不通过柯萨奇病毒和腺病毒受体(CoxsackieandAdreceptor，CAR)来感染细胞的Ad7就有了巨大的应用潜力【11。此外，应用多种不同血清型腺病毒载体疫苗联合免疫的效果要比使用单一疫苗要好的多，采用不同的基因疫苗来进行免疫可以提高抗HIV的免疫反应，如采用DNA初免，然后用腺病毒载体疫苗加强免疫可以明显的提高保护性免疫效果【261。基于以上问题，研究Ad7等不同血清型腺病毒载体并应用于构建重组活疫苗的研究逐渐增多，这种新型载体在免疫原性、转染效率、细胞靶向性、疫苗的安全性上都有很大的特点。当然目前感染性克隆也存在着一些问题：(1)感染性克隆也具有感染性，甚至感染性更强；(2)感染性克隆是通过人工手段得到的模拟病毒，和野生型病毒一样，在复制周期中它也会发生突变或重组；(3)感染性克隆在动物体内有可能朝不同的方向变异发展，所引发的致病作用可能不一致。总之，通过本文研究，不仅成功构建了Ad7感染性克隆PMDl8Ts-Ad7，也克隆了Ad7wzl基因组主要基因片段并进行序列分析，为下一步构建新型的重组腺病毒载体打下了坚实的基础，也为进一步应用于基因治疗及重组活疫苗方面的研究提供了良好的方法和策略。 温州医学院硕士学位论文小结1、克隆获得Ad7wzl基因组主要基因以提取的Ad7wzl基因组DNA为模板，PCR扩增得到Ad7wzlITR-L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3和ITR-R完整的基因，并将其克隆入pMDTM18．TSimpleVector中构建成重组质粒pMDl8Ts—ITR-L、pMDl8Ts—E1A261R、pMDl8Ts-E1855kDa、pMDl8Ts—Hexon、pMDl8Ts—E3和pMDl8Ts—ITR-R。限制性内切酶酶切和测序鉴定结果表明，连入的Adl和Adr基因序列分别与Genebank中公布的序列有较高的同源性，同时酶切结果与理论一致，表明各重组质粒构建成功。2、病毒基因组经酶切分析及BLAST比对确定分型分离得到的病毒基因组经酶切分析初步确定为Ad7d2t20】型，基因序列经BLAST比对与GenBank上的各基因组平均相似度比较后确定本文所得到的病毒基因组为7型腺病毒。3、分析了Ad7wzl基因组主要序列经测序及BioEdit软件分析比对，Ad7wzl与已在GenBank发表的五个Ad7基因组序列比较在核苷酸序列和相应的氨基酸序列同源性分别达至1J93．0％100．0％和98．0％-100．0％，有高度同源性。4、获得穿梭载体pMDl8Ts-Adl-Adr克隆获得Ad7wzl左右两端同源臂Adl和Adr完整的基因，并将其克隆入已引入BamHI和EcoRI位点的pMDTM18-TSimpleVector构建成穿梭载体pMDl8Ts-Adl．Adr。经酶切、PCR鉴定，载体构建正确，测序结果表明，连入的Adl和Adr基因序列分别与Genebank中公布的序列同源性极高，表明成功构建了pMDl8Ts．Adl．Adr穿梭载体。5、获得Ad7感染性克隆pMDl8Ts-Ad7穿梭载体pMDl8Ts-Adl．Adr经Pmel线性化后与Ad7wzlDNA共转化于感受态E．coliBJ5183中，氨卞霉素抗性平板筛选较小单茵落，挑取菌落培养并抽提质粒。限制性内切酶鉴定质粒为阳性克隆。将构建好的感染性克隆pMDl8Ts．Ad7转染至A549细胞，观通过倒置显微镜观察到转染5天后细胞发生明显CPE，提示pMDl8Ts-Ad7具有感染性，再次感染结果一致，说明具有重复感染能力，表明成功构建了Ad7感染性克隆pMDl8Ts-Ad7。6、本实验为下一步构建新型的重组腺病毒载体打下了坚实的基础，也为进一步应用于基因治疗及重组活疫苗方面的研究提供了良好的方法和策略。 温州医学院硕士学位论文参考文献【l】ZhangQW：SuXB，SetoD，eta1．Constmcfionandcharacterizationofareplication-competenthumanadenovirastype3-basedvectorasalive-vaccinecandidateandaviraldeliveryvector．Vaccine2009，27(1)：1145-1153．【2】NodaM，TetsuyaY,TakemasaS，eta1．Molecularandepidemiologicalanalysisofhumanadenovirustype7strainsisolated丘om1995nationwideoutbreakinJapan．JClinMicrobiol2002，40(1)：140—145．【3】UX，TikooSKeta1．Promoteractivityofleftinvertedterminalrepeatanddownstreamsequencesofporcineadenovirustype3．VirusRes2005，109(5)：51—58．【4】Chattier．C，Degryse．E，Gantzer．M，eta1．EfficientGenerationofRecombinantAdenovirusVectorsbyHomologousRecombinationinEscherichiacoli．Vtrology1996，70(3)：4805-4810．【5】TaniguchiT'PalmieriM，WeissmannC，eta1．QpDNA-containinghybridplasmidsgivingrisetoQpphageformationinthebacterialhost．Nature1978，274(5668)：223—228．【6】刘玉良，刘秀梵等．RNA病毒反向遗传操作技术研究进展[J】．中国病毒学报，2004，20(1)：90．94．[7]LmlerJL，eta1．vectorsasrecombinantviralvaccine．Vaccine1995，13(7)：11432-11511．【8】KathleenL，Berkner，PhilhpAeta1．Generationofadenovirusbytransfectionofplasmids．NucleicAcidsResearch1983，11(3)：6003-6020．【9】LuoJY，DengZL，LuoXJ，eta1．AprotocolforrapidgenerationofrecombinantadenovirusesusingtheAdEasysystem．NatureProtocols2007，2(5)：1236-1247．【10】Zakhartchouk凡YanZ，TikooSKeta1．ArecombinantE1-deletedporcineadenovirus-3asanexpressionvector．Virology2003，313(1)，377—386．【11】LiX，BabiukL八TikooSK，eta1．Analysisofearlyregion4ofporcineadenovirustype3．VirusRes2004，104(10)：181-190．【12】RobinsonHL，eta1．Newhopeforanaidsvaccine．NatureReviImmunol2002，2(7)：239-250．【l3】L．PaRersonJ，Robert-GuroffM，eta1．Replicatingadenovirusvectorprime／proteinbooststrategiesforHIVvaccinedevelopment．NIHPublicAccess2008，8(8)：1347-1363．【14]MortalN，O’NealWRiceKeta1．Administrationofhelperdependentadenoviralvectorsandsequentialdeliveryofdifferentvectorserotypeforlong-termliver-directedgenetransferinbaboons．ProcNatAcadSciUSA1999，96(12)：12816-12821．【15]BangariDS，ShuldaS，MittalSKeta1．Comparativetransductionefficienciesofhumanand5I 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温州医学院硕士学位论文附录一pMDTM18一TSimpleVectorInformation厥疆轿州囊峨科珏∞P^r∞rfⅣU密嫩^C^0盘^^^C^。“鲥C^0咐△^m似^^0TC口“跫呵盘。盘TT∞Cooc∽CCTCT台C^aq埘℃QTcC^0TrQcCCTC觯／GCTTCTTTGOC^‘嬲CcGTCG”僦矗^CGlCGTO^CTGGO^^^^∞cT∞CG’‘·—～CAGOAgT8^00≯rrTTGr．，G；kCCGOBejS=_S'I“g_釉口咖枞M13-47l嘶髀§圳峨＆脯V；：：：嚣籍；勰溢翟(化bn嘲弛)一I口辨e1日tAiIl口c●∞'驰一、⋯一⋯0⋯，pMD“”18．TSimpleVector是一种高效克隆PCR产(TACloning)的专用载体。本载体由pUCl8载体改建而成，它消除了pUCl8载体上的多克隆酶切位点，再在pUCl8载体的多克隆酶切位点处导入了EeoRV酶切位点，使用EeoRV进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。本载体尽管消除TLacZ基因上的多克隆酶切位点，但不影响B一半乳糖苷酶的正常表达，因此，PCR产物克隆后仍可以利用旺一互补性进行蓝白菌落的筛选，挑选阳性克隆。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行DNA酶切时，酶切反应将不会受到T载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。由于本载体以pUCl8载体为基础构建而成，所以它具有同pUCl8载体相同的功能。 温州医学院硕士学位论文pXbl质粒模式图：附录二B础n}ⅡlRIpXbl质粒为本实验室构建保存，该载体上含有BamHI、EcoRI、Nod--=个酶切位点，可以将已克隆的含BamHI、EcoRI位点的AdIL和含EcoRI、NotI位点的AdIR克隆进pXbl载体构建穿梭载体pXbl-AdIL-AdIR，为后续构建做基础。 温州医学院硕l：学位论文附录三Ad7wzlITR-L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3和ITR．R基因克隆测序的完整cDNA序列与4个在GenBank上已发表的Ad7基因组(AY594256、AY495969、AY601634、AY594255)经BioEdit序列比对图：(A)ITR-L：t{⋯⋯⋯’拭工TR—L1-500AY{95969AY601634AYS9唾256AY5942551—5BK005235．二J一1TR—Li—SOOAY{9S969^'r601634AY59圣256AYS9‘2551—5B五00S235工T豆一L1—500AY495969AY60163嘎AY594256丸Y5942551-5BK005235拼””⋯拾“”⋯括”r⋯并””⋯品国羹”君””⋯括”r⋯戈1201301‘0150160170180190200210220230240250260270ITR—L1—500AIY哇95969AY601634AYS9t256AY59{2551一SBK00S235一工TR—L1-500AY{9S969AY601E3{AYS94256AY59粤2551—5B五005235zJ}ITR—L1—500jAY495969iAY60163{iAY594256lA'L5942551—5lBIt,．0052352a02903003103203303‘035036037038039040041042043044045046’0’4+04jo{；o⋯茹(B)E1A2■¨一笤矗ir——一lay495969255256634235一二j弓69255256av601∈3{BK00523561R：矗一”⋯爿一”⋯崭”P⋯““”⋯爿～”⋯茸一”⋯拭”r⋯括“P⋯；；1001101201301{01501601701801902002102202302气0250匿。-GGA舶f555孽登裟吖"町酞曩委～札吖”"9S64S％””驺”凌蛩踺n吖叫"吖弧 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温州医学院硕士学位论文(D)Hexon：珏exonAY{9S96弓AY601E3‘AY59{25EAY594255己K00523SHexoⅡAY{95969AY601634AY59t256AY594255BK005235(E)E3：巴3E6v495av6016y594av594己K005_=J。。。．．。。．．．——．一￡3E：3三Iy495969307Ly601634f2961y594256f29e‘Y594255{255}K005235Z3Eav49596av60l63ay594256y55{25暑K0052：．j一30729e25829910203040矗”⋯⋯爿””⋯占“”⋯；ji00110120130140150160170180i90200210220230240250括～”⋯菇～⋯⋯括一⋯⋯“～⋯⋯括～⋯⋯括一”⋯岳一⋯⋯；j2802903003103203303403503603058i—O娃J』一一94E5S一63S53—962一n5l{45～o90拿9O—x{6S5O||踟甜址埘埘弧羔掰粥|蒙是菘獬猫曲孔％讣"懑辫眦善l如妒12．勋『rp瞻k巨罩掰援爿簇嚣一曲弘％"弘～峨Ⅲ“墅Ⅲ曩竺黧一蕊瓣甄黧一一i襞装三襞熏甄竺黧一藤糍甄黧叫翊习 温州医学院硕一J二学位论文307C2S8f298(299￡3EjV4959E9307ly601634f298ay594256(298ay594255‘299BK00523S～—．—。．．．．．一：3已1y{95969307(F)ITR．R：‘LTR—R51’AY4弓S565，AY601634溘Y5予{256}AY5弓{255}L卫R—AS1iAY49S96拿lAY60二63{；AY59{2S61AY594255}BK005235}ZTR-R514jAY{95，691AYE01∈34jAYSj{256；AY594255l己K0：二23S，209301701180ii9012U一460470480490500慝懑，{溱溪|I’m】599SO960970980990鞠臼¨“：2解裂鬻m票攀黼m哪陇嚣习薏出豢～{G6GAGⅢ董崭薹重萋甜。|曩曩⋯鑫鋈曩孵m蠢一∞蚕一n。鬟Ⅷm霾∥789如幻幻幻9{65％∞孙筋扭"虬¨¨∞|}|州讲妒啦{薹789∞∞幻∞的¨％弱弱”“铊蛇铅已鸲的"鹑∞酤町：；'甜吖旺¨★_荟 温州医学院硕士学位论文英文缩写英文名称中文名称60 温州医学院硕士学位论文附录五实验设计方案：l、分离培养Ad7wzl基因组并提取DNA、酶切鉴定。2、克隆Ad7wzl基因组主要序列：以提取的Ad7wzl基因组DNA为模板，PCR扩增Ad7wzlITR-L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3和ITR-R完整的基因，并将其克隆入pMDTM18．TSimpleVector中构建成重组质粒pMDl8Ts-ITR-L、pMDl8Ts．E1A261R、pMDl8Ts．E1855kDa、pMDl8Ts-Hexon、pMDl8Ts—E3和pMDl8Ts—ITR-R。限制性内切酶和测序鉴定质粒。3、Ad7wzl基因组主要序列分析：经酶切鉴定正确后将各重组子送大连宝生物测序并与已在GenBank发表的五个Ad7基因组序列进行BLAST比对，并用BioEdit软件对Ad7wzlITR-L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3、ITR-R区的序列及氨基酸等进行同源性分析。4、构建穿梭载体pMDl8Ts-Adl-Adr：通过引入BamHI和EcD对位点而改造了pMDTM18-TSimpleVector。利用PCR的方法，以提取的Ad7wzl基因为模板，扩增Ad7wzl左右两端同源臂Adl和Adr完整的基因，并将其克隆入已改造的p№Ⅸ18-TSimpleVector构建成穿梭载体pMDl8Ts．Am-Adr。限制性内切酶和测序鉴定质粒。、’5、构建Ad7感染性克隆pMDl8Ts-Ad7并转染A549细胞：穿梭载体pMDl8Ts-Adl-Adr经Pmel线性化后与Ad7wzlDNA共转化于感受态E．coliBJ5183中，氨卞霉素抗性平板筛选较小单菌落，挑取菌落培养并抽提质粒。限制性内切酶鉴定质粒。将构建好的感染性克隆pMDl8Ts—Ad7转染至A549细胞，观察细胞CPE情况以鉴定是否具有感染性。、61 温州医学院硕士学位论文致谢在此论文完成之际，我要向所有曾经关心、帮助过我的老师、同学致以最诚挚的谢意!首先，感谢我的导师吕建新教授和彭颖副教授。衷心感谢导师对本课题的悉心指导。吕建新教授严谨的治学态度、务实的工作作风、敏锐的科研思维潜移默化地影响着我，使我终身受益。同时，由衷的感谢彭颖副教授，您在科研上的积极探索和孜孜以求给了我科研道路上最生动的启发，彭老师在工作、学习和生活等各个方面对我无微不至的关怀和指导，令我万分感动，终生难忘。在研期间，能够遇到两位老师是我莫大的荣幸，在这里，再次向两位恩师表示崇高的敬意和衷心的感谢!三年的科研学习中，我得到了浙江省医学遗传学重点实验室各位老师的热心帮助，在此向你们表达最诚挚的谢意。非常感谢李祥、季敬璋、周怀彬、邹立林、郑易、金晶等老师在实验中给予的极大帮助。特别感谢郑晓群老师在实验课题方面的大力支持。感谢实验室的师兄沈鑫烽、师姐黄燕燕、余雪娇在实验过程中给予的细心指导。感谢我的同窗蒋璐茜、郑静、赵娜、冯晶晶、蔡小波等同学在工作、学习和生活方面无私的帮助。感谢浙江省医学遗传学重点实验室的所有同学及所有曾经帮助、关心、支持我的人。同时，衷心的感谢一直以来给予我极大支持与鼓励的家人和朋友们致以最崇高的敬意和最衷心的感谢!正是你们的存在，让我能够坚定的一路走来。最后，我由衷的感谢答辩委员会的各位教授，感谢您们提出的宝贵意见，我将在今后的工作中继续努力。62 温州医学院硕二仁学位论文综述腺病毒载体应用于基因治疗及疫苗的研究进展【摘要】近年来腺病毒载体作为基因转移载体己广泛应用于基因治疗及重组活疫苗研究的各个领域。其中5型腺病毒(Ad5)载体应用于肿瘤、遗传病等基因治疗领域最为常见，而7型腺病毒(Ad7)等新型腺病毒载体因其更大的安全性等特点已表现出巨大的潜力。本文就腺病毒载体的结构特点、构建方法、应用现状及问题做一综述。【关键词】腺病毒载体基因治疗疫苗早在20世纪80年代初就有人提出用一些病毒为载体来治疗诸如癌症和遗传疾病的观念。包括腺病毒载体、逆转录病毒等【11。重组腺病毒载体由于其自身具有宿主范围广、病毒基因组不整合入宿主染色体、病毒滴度高、外源基因表达水平高、捕人容量大等优点而应用得最为广泛。随着新型重组腺病毒载体的构建产生，目前已广泛应用于基因治疗和重组疫苗研究的各个领域。本文就腺病毒载体的结构特点、构建方法、应用现状及问题做一综述。一、腺病毒的生物学特性腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb。人腺病毒共52个血清型，分为A、B、C、D、E和F六个亚群{2-3】。基因治疗中常用的人2型及5型腺病毒在血清学分类上均属C亚群【4】。腺病毒是无包膜病毒，其衣壳呈对称的二十面体，直径为70-100rim，由240个六邻体亚单位及12个位于正二十面体顶部的五邻体亚单位组成。每个五邻体亚单位包括一个基体部分和一个突起的纤毛，基体部分参与组成衣壳。纤毛长短在不同血清型中各不相同，由l一个8"-'22重复基序(每个基序由15个B结构组成)的基轴将纤毛头部的小节和五邻体基体相连接。腺病毒通过其纤毛吸附到宿主细胞。纤毛的羧基端是一个球形结构，被称为纤毛小结。纤毛单体形成三聚体后与五邻体相连，腺病毒通过纤毛的小节与细胞表面受体结合(见图1)。 温州医学院硕士学位论文图1腺病毒模式图Fig．2Theideographofadcnovims根据腺病毒DNA复制的起始时间，基因组分为早期转录基因(E)和晚期转录基因(L)。早期转录基因包括E1A、E1B、E2A、E2B(TP、pol、PIVaII)、E3(ADP等)和E4。晚期转录起始于主要晚期启动子(MLP)。早期基因E1(E1A、E1B)表达蛋白参与病毒基因和有关细胞基因的转录，是病毒基因活动的起始因子；E2(E2A、E2B)主要功能是调节和参与病毒DNA的复制：E3的基因表达产物与病毒逃避宿主免疫系统有关，为病毒复制的非必需区，缺少大部分或全部E3，病毒仍能在组织培养细胞上繁殖；E4参与病毒DNA的复制、晚期基因表达、转录子的拼接和宿主细胞生物合成终止等活动。而晚期基因主要编码结构蛋白，为装配成熟的毒粒所必需，因此基因结构较稳定【5】。晚期转录区域有一个共同的三联先导序列(TPL)，由主要晚期启动子(MLP)所启动，转录产物为多顺反子，可长达20kb，通过不同的剪切加工，产生不同的mRNA，再翻译成不同的病毒蛋白。腺病毒(Adenovirus，Ad)作为一种研究得比较透彻的病毒类型，以其显著的优点如：①可高效地(体外实验效率通常接近100％)转导不同类型的人组织细胞；②可转导非分裂细胞；③在细胞培养物中有高滴度的重组病毒产量(>10¨／lIll)；④进入细胞内并不整合到宿丰细胞基因组，仅瞬时表达，因而安全性较高，已广泛应用于肿瘤基因治疗的转移载体，并取得了诸多可喜的成果[61。二、腺病毒载体的构建方法 温州医学院硕士学位论文构建腺病毒载体的主要思路是删除其早期基因(主要是E1A和E3A)的部分或全部，使外源基因能够通过同源重组的方式进入病毒基因的框架。目前主要有三种方法构建腺病毒载体：一是细菌内同源重组：将腺病毒全长DNA序列克隆骨架质粒中，转化大肠杆菌感受菌，在细菌中复制腺病毒DNA序列，然后将外源基因片段插入带适当抗性基因的真核表达质粒，将重组真核质粒线性化后，转化带骨架质粒的大肠杆菌发生同源重组，将外源基因表达盒插入腺病毒DNA中，用这种方法也可以缺失任何区段的腺病毒DNA[7】(图2)。一是在细胞内同源重组：首先要纯化出全长的腺病毒DNA，外源基因插入到带有腺病毒基因片段的穿梭质粒中，将腺病毒DNA和重组质粒共转染表达E1基因产物的细胞中，通过噬斑筛选出重组病毒【引。第三种方法是将稀有的限制性内切酶位点引入穿梭质粒和腺病毒骨架载体中，将外源基因克隆入穿梭质粒中，再通过酶切连接的方法将外源基因克隆入腺病毒骨架载体，转化大肠杆菌复制重组质粒，转染相应的包装细胞系后，即可产生复制缺陷型的重组腺病毒【91。?L翩它1乙。坠L。—§≥～三k』一A^‘重垃c翥鬻‘》rn聍囊圈曩霸隔翻霸啊翻霸霸霸■曩霸雹■—瞳翻曩■—霸—曩圈霸—曩曩曩—■固■圈曩面圈圜II。⋯。眨簧羔塑·坠垒羔k坠—卜—参黔2粉．#：z，、——州吃●芝：LBA《薹～ectofs_——一’—一I⋯Rep，i。le⋯ati1一：，rl。彬芝鋈兰至==二兰置二遂兰当引m叭一p雌州1■葱‘■————————一H。l『’cr¨高婴妻·_———t·——蒸—主譬疆ep《nde。¨‘’!：：：：：：二二磊磊ii嚣iiil露目目l§蘑自iiii茜；；；：：：：_’。_嘲霸嘲黼圈磁褥隧豳豳豳豳豳鞠蹑豳豳豳勰hstZci：tcpcIitl．i：Villcl‘’n。￡苎譬!]匾==：===：=二二二二二二二二==：=：：：======：=三Fsclcclivc互臣豹臼日=二======二二二二二二二二==：=：：：======：==：戛∈卫图2腺病毒载体的构建示意图¨6IFig．2Constructionschemaofadenoviralvector；A：Partialgenesofadcnovirus．B：Threeadcnoviralvectors．起初发展腺病毒载体是为了用于真核基因表达和疫苗研究，I丰要使用人Ad2和Ad5构建。重组腺病毒载体能容纳105％的外源基因。用于表达的rAd分为两类，一类是缺乏生长必需区，需要完整病毒的辅助的rAd，构建于80年代初期。另一类则不需辅助，即E1区缺失、E3区缺失或沉默区缺失的pAd。E1区缺失影响病毒复制，必须在表达E1蛋白的细胞系中包装，E3区缺失影响病毒的免疫逃避。所以，65 温州医学院硕士学位论文El区缺失的rAd更为安全；而E3区缺失的rAd不影响病毒复制，可设计为重组活疫苗，并且适于体外重组蛋白的表达。E1区的包装容量可达75kb，E3区的包装容量可达40kb，E1、E3双缺失可容纳50kb的插入片段【101。三、重组腺病毒载体的应用现状近年来，随着研究的进展腺病毒载体主要用于基因治疗和基因转移。基因治疗主要使用E1区缺失的Ad5型载体。l、腺病毒载体应用于肿瘤基因治疗在人类癌症的基因治疗中表达转基因的重组腺病毒载体显示出比较好的治疗效果【l¨。在肿瘤治疗方面现在主要有三种疗法：一是肿瘤抑制基因重组腺病毒载体：由于突变而造成功能丧失的p53基因与许多种人类肿瘤的形成相关【12‘1引。为了治疗这种缺陷并诱导肿瘤细胞的凋亡，已构建了多种携带野生型p53基因的载体。利用转基因的表达产物抑制和消除肿瘤。Ren等【14】用具有肿瘤特效的条件复制型腺病毒载体表达TRAIL进行肝癌的基因治疗研究。Sipo等【b】建立了一种改良的四环素作用的fasl腺病毒载体系统研究治疗肺癌。可以预见，随着腺病毒载体的不断发展，它必将会在肿瘤治疗的研究中发挥更大作用。二是溶癌腺病毒载体：1996年才有人宣称，带有E1B55k基因突变的腺病毒可选择性地在p53缺陷的肿瘤细胞中复制，因此可以作为溶解肿瘤的病毒来发挥作用【161。另外，最近的一项研究同时使用了E1B缺失的腺病毒和表达几．2的腺病毒载体，在一个鼠模型中使p53缺陷导致的胰腺癌完全消退了【l。71。三是构建重组活疫苗：利用表达粒性巨噬细胞集落刺激因子GM．CSF的重组腺病毒治疗黑色素瘤的临床试验显示了强大的抗癌效果【111，结果证实了高剂量腺病毒载体的注射给药是安全的，但是针对载体出现的免疫反应却消除了长期的抗肿瘤效应。2、腺病毒载体应用于遗传疾病基因治疗囊性纤维化是一种相对普通的隐性遗传疾病，由CFTR基因突变造成，导致氯离子传导性降低，钠离子吸收率升高。由于这种缺陷在肺里表现得很明显，因此对肺有亲嗜性的腺病毒成为可选择的递送该疾病治疗基因的载体之一。由于CARs的缺乏导致标准的Ad2／5载体不能感染高度分化的导气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞，已有人尝试过用阳离子脂质体和磷酸钙共沉淀的方法来提高病毒的感染率Il81。今后的载体能否提高转基因的表达效率和持续时间还有待于观察。 温州医学院硕士学位论文3、其他疗法．Ad5型载体也已用于帕金森氏病、乳腺癌、食管癌、杜式肌营养不良症、肥胖症、关节炎、软骨损伤、原发性肝癌等疾病的基因治疗。其中，E1855缺失的重组载体Adv-AFP．E1AdB能有效的摧毁HCC细胞，使裸小鼠的肝肿瘤减小。鲁峰等【19】利用腺病毒载体估证了Fas基因突变与瘢痕疙瘩之间的联系，为瘢痕疙瘩基因治疗展示了一条新途径。宋革等【20】成功构建了携带有目的基因METH21的腺病毒表达载体pAdEasy21METHl，而后转染增生性瘢痕动物模型，用于初步探讨血管靶向基因治疗，抑制增生性瘢痕的可行性。4、腺病毒载体应用于重组活疫苗Ad7做为口服活疫苗在美军新兵中使用，已有30多年的历史，由于它安全、可靠，并可在肠道里繁殖等特性，所以有着应用于基因治疗和制备活疫苗等领域的巨大潜力【2l】。在美国军队中出现腺病毒引起的呼吸道疾病之后，腺病毒疫苗已经彻底地检查了其安全性，这促进了针对人免疫缺陷病毒和狂犬病病毒的重组腺病毒疫苗的研制发展。‘其中HIV重组腺病毒载体疫苗已在人体进行了免疫试验【22】，腺病毒载体具有良好的反应性和亚型间的交叉反应，并且具有非常好的安全性。默克实验室从1996年开始研究HIV腺病毒载体疫苗，这种以Ad5构建的活载体疫苗的保护性在黑猩猩身上得到了验证。其后的实验都表明在试验动物和非人灵长类动物体进行的免疫试验表明可以刺激产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应。Ad5载体的一个潜在的局限性就是大部分人类个体(尤其是非洲撒哈拉人)具有对Ad5载体的预存免疫性(pre．existing"mmunity)，Ad5的预存抗体能在它们完成运输工作前中和掉Ad5疫苗载体。采用不同的基因疫苗来进行免疫可以提高抗HIV的免疫反应，如采用DNA初免，然后用腺病毒载体疫苗加强免疫可以明显的提高保护性免疫效果【231。基于以上问题，研究Ad7等不同血清型腺病毒载体并应用于构建重组活疫苗的研究逐渐增多，这种新型载体在免疫原性、转染效率、细胞靶向性、疫苗的安全性上都有很大的特点1241。四、问题及展望目前常用的腺病毒载体有着较大的免疫原性、感染率也不高且装载外源基因大小为7kb，为更有效、更安全地发挥其在基因疫苗和基因治疗上的作用，以下几个方67