稳定表达乙型脑炎病毒ns1蛋白细胞系的建立

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1、河北农业大学硕士学位论文稳定表达乙型脑炎病毒NS1蛋白细胞系的建立姓名：陈振师申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：汪恩强；华荣虹20120527摘要流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis，罐)是由乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)露l起豹严藿的人畜共患传染病，JEV与西尼罗病毒(WestNilevirus，WNV)、圣路易脑炎病毒(Saint-Louisencephalitisvirus，SLEV)和墨累滗谷脑炎病毒(／'durrayValleyencephalitisvirus,MVE

2、V)忍羁一个血清群，其广泛分布于系亚和南噩。NSl蛋自俸为一种膜功能相关耱蛋愈，可能参与病毒的晕期复制、RNA复制或病毒组装和释放，是主要的抗原成分之～。NSl蛋囱不参与组成毒粒，因而没有中和活性和血凝抑制活性，但它共有可溶性补体结合活性，可在不出现中和抗体的情嚣下诱生保护力，这种保护作用依赖于抗体的&片段。到麓翁势止，研究人爱对NSl蛋鑫的俸用撬制尚不十分清楚，这就要求对其结构、功麓及特性进行深入的研究。然丽，原核细胞表达的NSi蛋白不能彤成原有的分子构象，给研究带来局限性，因此需要建立麓稳定表达J嚣VNSl蛋囊的真核细胞系。本研究将乙型脑炎病毒SA

3、l4，董4屹株鲶NSl基因密码予优化舞，进行人王合成。将NSl基因亚炎隆至真核表达载体pCAGneo审并构建重组震粒，对其进行酶切鉴定和测序，该重组质粒为溺性，命名为pCAGneo。opti．JEV-NSl。将该阳性重组质粒转纯DH5ct感受态细胞，挑取单菌落并扩大培养，在无菌条件下提取质粒。将提取的质粒线性化爝调整至合适浓度，转染RK-13细胞，经过(3418加压培养，以有限稀释法筛选出一株稳定表达NSl蛋白的缨胞系。该细胞系经过RT-PCR、western-blot、IFA、免疫组化等方法鉴定，诞实NSI蛋囊在细胞内爵获褥稳定表达。本研究为深入探讨

4、NSl蛋自作用机制提供了可能性，为研究JEV的致病枫理和免疫枫铡奠定了基础。目前l瞄床上传统的疆诊断方法有一定局限性，如溺来检测JEV抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)是建立在抗体和抗原褶结合的基础上，爵能导致非特异性反应，进丽霹麓导致特异性抗体缀难被检寓或凌现假阳性结果。本研究以上述细臆系为靶细胞，通过朴体介导的缨胞毒镶试验(CDC)成功建立了一种毅型豹检测抗NSl矮自抗体的方法。该方法有较离的灵敏度、特异度翻敏感性，具有比ELISA方法更好的准确度。由于露前广泛疲用的灭活疫苗不能诱导机体产生抗NSI蛋巍的抗体，因丽该方法也为区别盎然感染和人工免疫

5、提供了理想手段，对J料的流行病学研究其有重要意义。关键词；乙型脑炎病毒；NSl蛋白；细胞系；孝}体介导的细腿毒性试验EstablishmentofstablyexpressingNSlproteincelllineofJapaneseencephalitisvirusMastercandidate：ChenZhenshiAdvisor：．Prof．WangEnqiangMajor．ClinicalVeterinaryMedicineAbstractJapaneseencephalitis(JE)isaseriouszoonosiscausedbyJap

6、aneseencephalitisvirus(JEV)。砀eJapaneseencephalitisvirusserocomplexofthefamilyFlaviviridaeincludesWestNilevirus(WNV)，SaintLouisencephalitisvirus(SLEV)andMurrayValleyencephalitisvirus(MWV)．JEVwidelydistributesinEastandSouthAsia．Asamembrane-associatedglycoprotein，NS1proteinisoneoft

7、hemajorcomponentsoftheantigen，itisinvolvedinviralearlyreplication,RNAreplicationandassembly,andreleaseofthevirus．NS1proteincannotbepartofvirusparticles，SOitshowsnoactivityinneutralizingandhemagglutinationinhibition．Additionally,foritsbindingactivityforsolublecomplements，itCanind

8、uceprotectiveimmunitywithoutneutralizationantib