无标记核酸探针的构建及其在高灵敏核酸检测中的应用

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1、学校代号：10532学号：S11222013密级：湖南大学硕士学位论文无标记核酸探针的构建及其在高灵敏核酸检测中的应用学位申请人姓名：蒸塾艳导师姓名及职称：重拦贤副教援培养单位：生物堂隧专业名称：生物医堂王猩论文提交日期：2Q!垒生Q三且2鱼目论文答辩日期：2垒!垒生竖县Q窆旦答辩委员会主席：割选明熬援ConstructionandApplicationofLabel-fleeNucleicAcidProbeforHighSensitiveNucleicAcidDetectionBySUHong

2、yanB．E．(GuangxiNormalUniversity)201AthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequrimentsforthedegreeofMasterofEngineerlnBiomedicalEngineeringintheGraduateSchoolofHunanUniversitySuperieorAssociateprofessorMENGXiangxianMay,2014湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论

3、文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：嚣弘耠日期：如I牛年o‘月IoEt学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容

4、编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口，在年解密后适用本授权书。2、不保密口。(请在以上相应方框内打“√”)作者签名：苴弘辛冬导师签名：主谇墨日期：勘蛑D阳膨日日期：知f≯年a‘月，。日无标记核酸探针的构建及其在高灵敏核酸检测中的应用摘要核酸探针作为现代研究生命科学的一种基本检测工具，与一般的检测方法相比，具有高灵敏度、强稳定性、高特异性、易于合成、设计简单等优点。科研工作者在已经研发出的核酸探针基础上，不断开发出一系列新型核酸探

5、针及其检测方法，并广泛应用到生物学、化学、医学诊断以及疾病检测等多个领域。基于此，本论文基于循环链置换扩增技术和核酸外切酶I，构建了新型无标记核酸探针，并应用于核酸的高灵敏检测，具体开展了以下三个方面的工作：1、发展了一种基于聚合酶链置换循环扩增的无标记长尾核酸探针体系。在此体系中，核酸探针既可以作为靶分子的识别探针又可以是聚合酶的反应模板，并且结合具有链置换活性的聚合酶，设计简单、操作简便，成本低。并且，该体系中无需直接扩增目标分子，在等温条件下实现循环聚合反应，不容易发生由于外源性污染导致的

6、假阳性反应，可以对核酸进行定量检测分析。2、发展了一种基于新型核酸探针介导信号放大方法用于高灵敏检测核酸。新型长尾核酸探针的长尾在引物退火延伸过程中延能长双链DNA产物，嵌入更多的SG荧光染料分子，释放出强的荧光信号，与循环扩增反应相结合，提高核酸检测的灵敏度，检测下限达到50aM。与分子信标探针检测方法相比。该方法的优势在于不用标记，且长尾探针介导的产物能使检测信号放大，进一步提高核酸检测的灵敏度。3、发展了一种基于核酸外切酶I的新型核酸探针用于超灵敏检测DNA或miRNA。核酸外切酶I能特异

7、性从3’一5’切割DNA单链，当没有靶分子存在时，其能效地从3'-OH端降解探针和引物，很大程度上降低荧光背景信号，提高了信噪比，使核酸检测灵敏度得到大幅度提高。在有靶分子存在条件下能诱发等温链置换聚合反应后形成大量长的DNA双链产物，产生很强的荧光信号，使新型核酸探针的检测灵敏度达到PCR级的检测水平，检测下限为5zM，比一般分子信标探针的检测下限降低了6个数量级。此外，该方法也能检测相似度很高的不同miRNA分子，其检测下限也达到5zM，说明方法的选择性很好。关键词：无标记长尾核酸探针；链置

8、换聚合反应；核酸外切酶I；核酸II硕士学位论文AbstractNucleicacidprobesasabasicdetectiontoolformodernresearchinthelifesciences，comparedwiththegeneraldetectionmethod，possessintrinsicadvantagessuchashighsensitivity，goodstability，highspecificity，easysynthesis，simpledesignandS